真菌生物基本分子实验(疏水蛋白为例).pdf

忠于事实 1 信奉自然 真菌生物学基本分子实验（核酸和蛋白质提纯测定） 一、实验背景： fungalhydrophobin 真菌疏水蛋白 （ ）是一类小分子分泌蛋白。它是真菌生命 周期的基本因素，多数丝状真菌的顶端菌丝可分泌该蛋白，是细胞的一种延伸结 构。这类蛋白在真菌黏附基质表面及气生菌丝的生长发育过程中发挥着极其重要 的作用。 8 Cys 真菌疏水蛋白特征是 个半胱氨酸（ ）残基以二硫键链接成特殊的方式 排列于氨基酸序列中。根据Cys残基间距和亲水疏水氨基酸的分布方式分为Ⅰ型 8 疏水蛋白和Ⅱ型疏水蛋白，蛋白质序列中疏水性氨基酸残基占有很大比例。 个 Cys 4 Cys 保守 之间形成 个二硫键，其中第二个和第三个、第六个和第七个 总 是连在一起。结构通式为： X —C—X —CC—X —C—X —C—X —CC—X —C—X 2～139 5～10 11～14 8～23 5～6 6～18 2～13 C X 代表半胱氨酸， 代表除半胱氨酸的其它所有氨基酸。第一个半胱氨酸前 氨基酸序列差异较大，而且很多疏水蛋白存在糖基化。一般情况下Ⅰ型疏水蛋白 在Cys 和Cys 之间所形成的环状结构长度大于Ⅱ型疏水蛋白，而且在其N端第 3 4 一个半胱氨酸残基前含有一段较长的系列，形成的组装体决定着蛋白膜的亲水侧 性质。 Ⅰ型疏水蛋白结构为X —C—X —CC—X —C—X —C—X —CC 26～85 5～8 17～19 8～23 5～6 —X —C—X ，主要由担子菌和子囊菌产生，其组装体具有极高的不溶性， 6～18 2～13 可抵抗2%的十二烷基磺酸钠 （SDS）溶液在100℃条件下的抽屉，但能够被100% 三氟乙酸（TFA）通过破坏单体间短程的疏水作用将其解离为可溶性单体。根据 疏水蛋白组装体溶解特性和自组装膜疏水侧特有“小杆层”结构的呈现，糙皮侧 耳所产疏水蛋白已确认为典型的Ⅰ型疏水蛋白，其单体大小约为8kDa,二聚体约 为15KDa。 目前研究得最广泛的是Ⅰ型疏水蛋白SC3，该蛋白是菌体形成气生菌丝所必 需的结构，当SC3接触到空气和水或水和疏水物质 （矿物油）的界面时其单体启 动自组装过程，自发形成一种类似两性分子膜结构的聚合体，而且十分稳定，只 有通过TFA抽屉才能将其破坏。SC3聚合体这种两性分子性质只有通过自组装才 能完成，该过程包括SC3构象的变化。组装好的SC3疏水蛋白在一侧高度疏水， 与水分子接触角度约为110°，其亲水一侧与水作用的角度约为36°,这在一定 程度上是因为SC3糖基化使得甘露糖残基暴露于亲水侧。当膜形成于疏水性固体 表面时其亲水面暴露，当膜形成于亲水性固体时其疏水面暴露，呈现了疏水蛋白 自组装膜的两个极性相反的表面。也就是说当疏水蛋白的自组装介导菌丝附着于 疏水物质表面时形成亲水层，当其遇到疏水物质表面后会发生自组装形成疏水 层。疏水蛋白都是通过在极性相反的液-液界面自组装成疏水和亲水两性蛋白膜 的机制来降低界面张力和自由能。 Ⅱ型疏水蛋白结构式为X —C—X —CC—X —C—X —C—X —CC 17～67 9～10 17～39 16 6～9 —X —C—X ，仅由子囊菌产生，其组装体稳定性相对较差，能够溶解在60% 10 3～7 雲動興河 忠于事实