AG490对大鼠创伤性脑损伤急性期小胶质细胞激活影响.docVIP

AG490对大鼠创伤性脑损伤急性期小胶质细胞激活影响小胶质细胞是中枢神经系统的免疫防御系统的主要介质［1］，是创伤性脑损伤后炎症反应不可缺少的部分［2-3］。在各种创伤、感染等病理状态下，小胶质细胞被激活，释放促炎细胞因子如白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导炎症反应［4］。CDllb是实验研究中鉴定小胶质细胞的主要表面抗原物质［5］，静息状态下的小胶质细胞表面抗原CDllb极少表达，活化后其表达明显升高。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，是JAK激酶/信号转导和转录激活因子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription， JAK/STAT）信号通路的抑制剂，目前尚未应用于临床［6］。近年来关于AG90的研究范围已涉及生物学的诸多方面，包括抗肿瘤研究、免疫反应机制研究等［7-10］，但其在创伤性脑损伤中的作用研究相对较少。本研究就AG90对创伤性脑损伤急性期小胶质细胞激活的影响进行探讨。 1 材料与方法 1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠120只（体质量250～300 g），购于河北省实验动物中心，于安静、温暖、避强光的环境中饲养。随机数字表法分为对照组（n=40）、TBI组（n=40）、TBI + AG490组（n=40），每组再分为6、12、24、72 h四个亚组，每个亚组各10只动物。所有大鼠用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，剪去头部毛发并固定，常规消毒铺巾，正中矢状位切开头部皮肤，剥离颅骨外膜，在左侧距离矢状缝、冠状缝各5 mm处用牙科钻钻直径4 mm的骨窗，保持硬脑膜完整，骨蜡止血。对照组仅行开窗，不予以创伤。TBI组及TBI+AG490组采用液压冲击法致伤动物，于伤后1 h进行NSS评分［11］，以确保各组有相似损伤程度。TBI+AG490组大鼠于伤后1 h腹腔注射AG490 5 mg/kg，对照组和TBI组大鼠给予等渗盐水腹腔注射5 ml/kg。于规定时间处死动物，各亚组随机取5只动物，切取伤灶周围脑组织用于CD11b检测及组织病理学检查；5只用于干湿质量法检测脑组织含水量。 1.2 主要试剂及仪器 PE-ANTI-RAT CD11b（美国BioLegend公司），AG490（美国ALEXIS BIOMOL公司），流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），Olympuscx21光学显微镜（日本Olympus公司），LeicaRM2125轮转石蜡切片机（德国Leica公司）。 1.3 小胶质细胞表面抗原CD11b表达测定 按以下步骤处理：取脑组织约1 g于平皿中，加入PBS缓冲液，将平皿置于冰水混合物中，仔细剥除脑组织表面的脑膜及血管，用眼科剪将组织剪至匀浆状，用20 ml注射器吸取组织匀浆，用100目细胞筛过滤到试管内，再经300目细胞筛过滤掉细胞团块，制备成单细胞悬液；1000 r/min离心5 min；弃上清液，用振荡器使细胞分散，用100 μl PBS缓冲液重悬；每个样品收集2×106细胞；1000 r/min离心5 min；加一抗10 μl，4 ℃孵育30 min，1000 r/min离心5 min；去上清液，加PBS缓冲液定容至500 μl；上机检测。上述过程均同时设有阴性对照（不加入任何抗体）。 1.4 脑含水量测定实验 处死大鼠后开颅经大脑中线切开，去掉嗅叶与小脑，滤纸吸掉脑组织表面水分，电子分析天平称量伤侧脑组织湿质量。称湿质量后，于 70 ℃恒温干燥箱中36 h烘干至恒重，称量获得干质量。根据Ellit公式计算脑含水量：脑水含量（%）=（湿质量-干质量）/湿质量×100 1.5 组织病理学实验 取脑组织于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，再经脱水、透明、包埋，在石蜡切片机上进行5 μm连续切片，展片后用载玻片捞取切片烤干，然后按照以下步骤进行：石蜡切片常规脱蜡入水；自来水冲洗5 min；苏木精染色10 min；自来水冲洗1 min；1%盐酸酒精分化30 s；自来水冲洗1 min；伊红染色30 s；自来水冲洗1 min；常规脱水；透明、封片；光学显微镜观察。 1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0软件包分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）统计，组间比较采用LSD-t检验。以P0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 流式细胞术检测CD11b表达 TBI组脑组织CD11b表达在伤后6 h即开始升高，在12 h达（30.7±1.39）%，72 h仍处于较高水平，与对照