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Western Blot基本原理及操作
Western Blot基本原理及操作
中山医院临床医学研究院
侯嘉云
hou.jiayun@zs-hospital.sh.cn
Michael A. Milhollen, cancer research, 2011
流程
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白定量
蛋白定量
• 简介
以医院logo颜色为整体色系,总体以简洁、
突出ppt展现内容为主。
• 简介
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样品准备
样品制备过程中的一些要点与建议
• 收集细胞离心时转速需适当;
• 尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子;
• 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的对蛋白
修饰的改变,制备过程应在低温进行;
• 样品建议分装成合适的量,然后冷冻干燥或直
接以液体状态置-80℃中保存,但要注意不要反
复冻;
• 煮样时防止爆管
分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶制备-分离胶
灌制分离胶 隔绝空气
ddH O
2
0.1%SDS:8%
异丁醇:8%
浓缩胶(5%)
凝胶制备-积层胶
灌制积层胶 插入梳子
制备凝胶中的要点
• AP要新鲜配制;
• 混合搅拌速度太快易产生气泡影响聚合,导致电泳带畸
形,太慢不均匀;
• 分离胶勿倒的过满,需留一定的空间;
• 凝胶需缓慢凝固,TEMED、AP用量过多会导致胶太硬,
从而电泳时易烧胶
• 保持所有装置清洁;
• 试剂要有正确的pH值,及妥当的保存
凝胶电泳
上样的注意要:
• 20--50ug总蛋白
或100ng纯蛋白,
可根据蛋白表达水
平进行优化;
Staking gel • 尽量保持每个泳
道的蛋白量一样,
体积尽量一致;
Separating gel
• 样品两侧的及空
置的泳道用等体积
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