Western Blot基本原理及操作.pdf

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Western Blot基本原理及操作

Western Blot基本原理及操作 中山医院临床医学研究院 侯嘉云 hou.jiayun@zs-hospital.sh.cn Michael A. Milhollen, cancer research, 2011 流程 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白定量 蛋白定量 • 简介 以医院logo颜色为整体色系,总体以简洁、 突出ppt展现内容为主。 • 简介 以医院logo颜色为整体色系,总体以简洁、 突出ppt展现内容为主。 样品准备 样品制备过程中的一些要点与建议 • 收集细胞离心时转速需适当; • 尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子; • 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的对蛋白 修饰的改变,制备过程应在低温进行; • 样品建议分装成合适的量,然后冷冻干燥或直 接以液体状态置-80℃中保存,但要注意不要反 复冻; • 煮样时防止爆管 分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶制备-分离胶 灌制分离胶 隔绝空气 ddH O 2 0.1%SDS:8% 异丁醇:8% 浓缩胶(5%) 凝胶制备-积层胶 灌制积层胶 插入梳子 制备凝胶中的要点 • AP要新鲜配制; • 混合搅拌速度太快易产生气泡影响聚合,导致电泳带畸 形,太慢不均匀; • 分离胶勿倒的过满,需留一定的空间; • 凝胶需缓慢凝固,TEMED、AP用量过多会导致胶太硬, 从而电泳时易烧胶 • 保持所有装置清洁; • 试剂要有正确的pH值,及妥当的保存 凝胶电泳 上样的注意要: • 20--50ug总蛋白 或100ng纯蛋白, 可根据蛋白表达水 平进行优化; Staking gel • 尽量保持每个泳 道的蛋白量一样, 体积尽量一致; Separating gel • 样品两侧的及空 置的泳道用等体积

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