关于PCR引物设计.ppt

* * * * * 　 ?? UTR在人mRNA中的结构示意图 UTR（Untranslated Regions)即非翻译区，是信使RNA（mRNA）分子两端的非编码片段。 　　5-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子，3-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。 ，从基因序列、细胞、动物实验以及临床治疗等多个层面和角度，对小檗碱降低血中胆固醇和甘油三酯的药理作用、药效和分子机理进行了系统研究。他们发现，小檗碱是在基因转录后水平上，通过作用于3UTR区域稳定低密度脂蛋白受体的mRNA（信使核糖核酸）来降低血脂的，与目前使用的他汀类降血脂药物的作用机理完全不同。这在理论上为寻找新型降血脂药物提供了新的分子靶点 * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * File菜单中的Parameter命令可以对系统参数，PCR反应条件和程序打分系统进行设置，以帮助用户根据自己的特殊要求来进行引物设计，其中反应条件按照引物浓度，单价离子浓度，Mg离子浓度，Na盐浓度等。而打分系统是参照的以下公式： 根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。 * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * * 广西医学科学实验中心xy * 引物设计（Primer Design），酶切分析（Restriction Sites）和基序分析（Motif） 当一个基因被识别、其DNA序列被解读时，人们往往仍然无法 弄清相应的蛋白序列是什么。这是因为在没有其它信息的前提下，DNA序列可以按六种框架阅读和翻译 （每条链三种，对应三种不同的起始密码子）。阅读框的次序（+1,+2, +3,-1,-2,-3)。 创建新序列文件 * 广西医学科学实验中心xy * 将模板序列粘贴进入 点击进入引物设计模块 最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑 显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示 显示两个引物的各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC％、简并性 有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物间二聚体结构的预测 显示的是对PCR扩增有影响的结构的位置，结构细节和稳定能 根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要有哪些信誉好的足球投注网站的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定有哪些信誉好的足球投注网站引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。 * 广西医学科学实验中心xy * 点击search 点击参数设置 GC夹 引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5’末端。这一段有较强稳定性的5’末端称为GC钳，它保证引物与模板的稳定结合。 * 广西医学科学实验中心xy * Degeneracy(多义性）：当设计多义引物时，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性。应尽量避免3’末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物的延伸。 3’末端稳定性：引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5’末端和相对稳定性较弱的3’末端。如果3’末端稳定性强，有可能在即使5’末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带。 在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。 利用引物编辑窗口对程序自动找到的或手工找到的引物序列进行编辑，以便用户能在引物引入突变及加入特定的酶切位点，并对修改后的序列的二聚体结构、发卡结构和错配进一步评估。 除了以上的直观地对引物进行基本的设计和评估功能外，该程序还提供了多种数据报告，主要通过Report菜单和Graph菜单中命令来实现。 △G是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且