实时荧光定量PCR实验设计.pdf

实时荧光定量PCR实验设计 实时荧光定量PCR实验设计 提纲 提纲 •实时荧光定量PCR实验要素 •实时荧光定量PCR实验设计及优化 •复合PCR及基因表达 •SYBR Green 实验tips 实验要素 • 目标基因： 未知样品 •生成标准曲线： 标准品梯度 •监控系统故障： 阳性对照 •监控污染： 阴性对照/基因组对照 •校准生物学误差：看家基因 •降低其余误差： 重复实验 样品 •模板可以是gDNA、cDNA、质粒、PCR产物；RNA需要反转录成 cDNA •RNA可以直接定量，前提是RT 的效率一致 •DNA纯度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6 ~ 2.0之间 •DNA用量：0.1 ng -1 ug，最好10-100 ng/rxn •DNA处理：基因组DNA及质粒DNA •RNA纯度：OD260/OD280=2.0 •RNA用量：60 ng –2 ug/ RT-rxn ； •RNA处理：DNA酶处理 •cDNA用量：1-100 ng RNA反转录所得cDNA加1 uL/rxn •注意：100 uL的反转录体系最多可以反转录2 ug 总RNA ；如果2 ug ，分成几管 标准品 目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系 不要求： • 数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA • 可以使用相同的DNA （目标基因质粒，目标基因CDNA ） • 也可以使用不同的：PCR产物、质粒、病毒、人工合成片段…… 要求： • 5点以上 • 浓度已知 • PCR效率一致，且接近100% –•仪器一致 –•反应条件一致：循环参数、同一次实验 –•试剂质量一致：模板、引物和探针Tm值、酶及缓冲液 梯度稀释方法 •选择目标、提取/PCR 、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释 •CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 Each tube remove 10μl sample 108 7 106 5 4 3 2 1 10 10 10 10 10 10 Each tube contains 90μl H 0 2 测定PCR效率 • Efficiency (η) = [10(-1/斜率)] - 1 •作标准曲线：直接确 定E PCR扩增效率 E Slope 0.5