2005年版药典细菌内毒素检查法培训版.ppt

2005版药典细菌内毒素检查法;细菌内毒素检查法;细菌内毒素标准品; ng与EU换算 ;3．因为家兔最低致热量的试验是一公斤体重注射10ml从上述对照中得出静脉输液的内毒素限量为0.5EU/ml。 二．同样用以上方法测后来制备的EC5，共做113次对照试验，得出1ng=10.3EU，取整数为1ng=10EU。 三．我国第一个国家标准内毒素“79-5”（上海生物制品研究所张天仁教授制备）家兔最低致热量为1.93ng/kg，如按上述换算，1ng约等于2.5EU，可见其致热活性略低于EC2和EC5。 ;细菌内毒素检查用水;实验器材;理化性质;供试品溶液的制备;最大有效稀释倍数（MVD）; 方法1 凝胶法;鲎试剂灵敏度复核试验 1;鲎试剂灵敏度复核试验 2;鲎试剂灵敏度复核试验 3;干扰试验 1;;干扰试验 2;干扰试验 3;凝胶限量试验1;凝胶限量试验2;注射用硫酸链霉素的细菌内毒素检查法 ;一、试剂和样品 鲎试剂（批号：040330 灵敏度：0.5EU/ml；批??：040317 灵敏度：0.25EU/ml；规格均为0.1ml/支；湛江海洋生物制品厂生产） 细菌内毒素检查用水（批号：031229 规格： 2ml/支；湛江海洋生物制品厂生产） 细菌内毒素工作标准品（内毒素工作标准品2004-2，160EU/支，中国药品生物制品检定所提供） 注射用硫酸链霉素（规格：1.0 g/瓶 批号 生产厂家：大连美罗大药厂） ;二、干扰实验： （一）、限值的确定： 由于2000版中国药典细菌内毒素检查法没有收载注射用硫酸链霉素品种的内毒素限值，按照2005年版中国药典细菌内毒素检查法内毒素限值的计算方法，在此我们通过计算并参考美国药典25版注射用硫酸链霉素规定的内毒素限值L=0.25EU/mg。 L=K/M=5.0EU/kg.hr/1200mg/60kg.hr =0. 25EU/mg M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以《临床用药须知》和《化学药品说明书汇编》所载的临床剂量为准(M=1.2g)。;补充说明：2005年版中国药典二部附录《细菌内毒素检查法》 内毒素限值的建立 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M 式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U活性单位表示；K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5E U/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h)；M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U活性单位/ (kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。 ;（二）、干扰试验浓度的计算： 按照中国药典2005年版提供的公式计算最大有效稀释倍数，选用鲎试剂的灵敏度λ为0.5EU/ml和0.25EU/ml ，用4ml细菌内毒素检查用水将样品注射用硫酸链霉素溶解，则C=1000mg/4ml=250mg/ml。计算方法如下： MVD=CL/λ=250×0.25/0.25=250倍 这里涉及到样品的浓度C，因不同检验操作人员可能选用不同体积的细菌内毒素检查用水溶解样品，这样每个检验操作人员的样品浓度C都不同，计算出的最大有效稀释倍数MVD也不同。对于粉末类药品，我们直接通过对内毒素限值表达方式的变换，就可以得到干扰试验用的药品浓度，而不必用MVD公式计算。 L=0.25EU/mg=0.25EU/ml/1mg/ml =0.5EU/ml/2mg/ml=0.125EU/ml/0.5mg/ml =0.06EU/ml/0.25 mg/ml ;(三)、预试验;（四）、凝胶法干扰试验溶液的制备 干扰试验溶液的制备见下表，各溶液制备方法如下： ;补充：1、在哪种条件下要做灵敏度复核试验？ 答：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 2、在哪种条件下要做干扰试验？ 答：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 ;1、供试品溶液： 注射用硫酸链霉素溶解稀释： 用细菌内毒素检查用水(4ml)将其溶解并稀释到4.0mg/ml 、2