显微切割技术章.pdf

第七章 显微切割技术 人体组织是由相互作用的不同的细胞群体组成的，这些细胞群体彼此组成复 杂的三维结构，每种细胞均有自己的独特的mRNA 与蛋白质表达（表现型）。因 此在复杂的组织中取得同质性的样本是相当困难的。尤其在肿瘤的病理学研究 中，样本的同质性是经常遇到的问题。例如，霍奇金病的肿瘤细胞—— Reed-Sternberg 细胞和Hodgkin 细胞（R-S/H 细胞），通常单个分散在大量的反应 性细胞（如淋巴细胞、组织细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞）组成的背景之中，给 R-S/H 细胞起源的研究带来很大的困难。随着分子病理学研究的深入，需要分离 的样本越来越小，从大块的组织精确到单个的细胞，甚至细胞器或者染色体。常 规的研究方法对此无能为力，而显微切割技术的出现解决了上述难题。 在显微切割技术（microdissection technique）发展之前，进行原位的细胞表 型的研究方法是免疫组化和原位杂交。但是免疫组化和原位杂交方法一般只能局 限于一种或是几种基因表达的分析，而且难以进行DNA、mRNA 和蛋白质的定 量分析（如突变、缺失）。显微切割技术能够对于组织病理学上确定的细胞群（甚 至精确到一个特定的细胞，或特定的细胞器或特定的染色体）进行分子病理学研 究，达到高度敏感性和高度特异性的统一。尤其是在需研究的细胞只占样本中细 胞的少数时，以及需研究的细胞呈散在分布时，显微切割的重要性尤为明显。加 之现在的免疫组织化学和原位杂交等技术可以在切片上特异性定位所需的细胞， 因此显微切割技术在最近几年中得到了迅速地发展。由于和高通量 （high-throughput）基因分析（基因芯片）以及蛋白分析技术结合，显微切割技 术显示出良好的发展前景（图7-1）。 图7-1 一、 显微切割技术发展的回顾 组织显微切割的概念尤为简单，即直接在光学显微镜下从异质性的组织样本 中选取某一特定的细胞群。实际上，要达到这一目的在技术上经历了以下几个阶 段：早期是从冰冻组织切片上在肉眼下用解剖刀刮去不需要的部分，剩下感兴趣 [1] 的组织。如1965年，Baxter 对肾小管进行的显微切割的研究 。后来发展成在 1 显微操作仪（micromanipulator）引导下使用带有粘附尖端的解剖针或者吸管， 进行手动切割和提取（图7-2），使得精确性和实用性大为增强。如上个世纪90 [2] 年代初德国Hansmann等使用这一方法对R-S/H 细胞的研究 。这些方法基本上 为手动，精确性低，费时费力，可重复性差，而且不能完全避免污染。1992年 美国国立癌症研究院的Liotta 等人研发的选择性紫外辐射分离技术（selective ultraviolet radiation fractionation，SURF）带来技术上的重大突破，该方法在切片 上先用墨水选择性的覆盖需要的细胞或组织，然后用高能量的紫外激光束破坏周 [3] 围无关组织中的DNA。墨水覆盖区的细胞的DNA 得以保存，再用解剖针采集 。 1995 年Liotta 教授等进一步发展的膜覆盖组织的非接触性激光显微切割技术 （non-contact laser microdissectionof membrane-mounted native tissue）使得显微切 割实现了高度精确、无污染、快速和自动化。将热敏的乙酸乙烯薄膜覆盖在组织 切片上，用激光束（100mJ～200mJ）直接照射需要的细胞群，薄膜受热而与下 7-3 PCR[4] 面的组织紧紧粘住，掀开薄膜就可将靶组织粘在薄膜上（图 ），可用于 。 另一种激光捕获显微切割术（l