病原分子生物学实验技术-2013.pdf

病原分子生物学实验技术 王荡 wangdang511@126.com 华中农业大学动物病毒室 2013级 实验内容 实验一、聚合酶链反应（PCR） 实验二、外源DNA片段的克隆 实验三、感受态细胞的制备 实验四、细菌转化 实验五、质粒的小量制备与鉴定 实验六、质粒的大量制备 实验七、原核表达与表达产物的提取 实验八、SDS电泳 实验九、病毒基因组DNA的提取 实验要求 1、注重实验设计 2、严格操作程序 3、注意生物安全 4、了解实验原理 实验预期目标 1、掌握DNA操作和原核表达的基本实 验技能 2、提高独立进行实验设计的能力 3、了解DNA操作和原核表达实验技术 的基本原理(自己查资料） 参考书：分子克隆实验指南 本实验技术课程的总体思路 基因克隆 PCR扩增 表达载体构建 酶切、鉴定 蛋白表达与分析 原核表达、SDS 实验一 聚合酶链反应（PCR ） 引物的设计 已知基因序列 部分序列已知 5’/3’ RACE 高度变异序列 简并引物 实验一 聚合酶链反应（PCR ） 模板的处理 细菌 细胞培养物 质粒 病毒基因组DNA 病料 鼻拭子 实验一 聚合酶链反应（PCR ） PCR PCR （DNA) RT-PCR (RNA) 套式PCR 荧光定量PCR 实验一 聚合酶链反应（PCR ） 以原核表达PRRSV ORF7基因为例 引物设计 模板制备 PCR反应体系以及扩增条件 PCR产物电泳检测 载体选择 蛋白特性分析（信号肽、跨膜区） /tools/ SignalP软件 引物设计 上游引物：ATGCCAAATAACAACGGCAAGC 下游引物：TCATGCTGAGGGTGATGCTGTG 引物设计原则  引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大 于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应  引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引 发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大  引物3’端的末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基  5’端序列对PCR 影响不太大，常用来引进修饰位点或标记物 酶切位点添加 载体自连？ PRRSV ORF7酶切位点 插入方向？ 同尾酶？ 读码框校正（BamH I+Hind III ） 30a（+） 5‘-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGAAAGCTT -3’ Gly-Ser-Met-(PRRSV ORF7)-(TGA) 读码框校正（Sal I+Xho I ） 30a（+） 5‘-CGTCGACATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTC