第1章 疏水层析.pdf

生物大分子的分离与表征生物大分子的分离与表征 第1章、疏水层析 第2章、反相层析 第第33章章、色谱聚焦层析色谱聚焦层析 第4章、高效液相色谱 第5章 重组蛋白的分离与分析 第5章、重组蛋白的分离与分析 第6章、抗体纯化技术 A) 疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析 ，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基 与流动相中的与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结些疏水分子发生可逆性结 合而进行分离的层析技术合而进行分离的层析技术。 从作用机制来看，它属于吸附层析。 从作用机制来看，它属于吸附层析。 非极性化合物例如苯非极性化合物例如苯、、环己烷在水中的溶解度非常环己烷在水中的溶解度非常 小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 ((HHyddrophhobibicitity))。 非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应疏水效应 (Hydrophobic effect) 。 疏水作用(hydrophobic interaction): 非极性分子进入水中，有 聚集在聚集在一起形成最小疏水起形成最小疏水 面积的趋势面积的趋势，，保持这些非保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。 对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包 埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的 热动力学折衷的结果热动力学折衷的结果。 就球形蛋白质的结构而言， 其分子中的其分子中的疏水性残基数是从疏水性残基数是从 外向内逐步增加的。 虽然疏水氨基酸大多被包 埋在球形蛋白内部，有些则暴 露在外露在外，在蛋白质表面形成疏在蛋白质表面形成疏 疏水和亲水部件表面的溶菌 水区域，这部分暴露在外疏水 酶。 酶。 性基团称为疏水补丁。 最疏水部分是深红色,浅红色 的更少的疏水性。最亲水部 分分显示在在深蓝色的蓝色的,更少的亲少的亲 水部分是浅蓝色。 1.2、疏水层析原理 A)) B)) 高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。 疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。 在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。  亲水性强的亲水性强的蛋白质蛋白质与与疏水性疏水性固定相固定相结合作用原理结合作用原理 ◦靠靠蛋白质表面的蛋白质表面的一些些疏水补丁疏水补丁 ((hydrophobichydrophobic patch)； ◦令蛋白质发生局部变性 (可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基； ◦高高盐作用盐作用。疏水层析的特性所致疏水层析的特性所致，即即在在高高盐浓度盐浓度 下 暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 固定相作用。 一般在lmol／L (NH4) SO 或 2mol／L 2 4 NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质 ，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固 定相结合在一起。 然后通过然后通过降低流动相的离子强度降低流动相的离子强度，，即可将结即可将结 合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进 行解吸附。 行解吸附。  也就是：疏水作用