荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍 [兼容模式].pdf

荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍 南京润亚 宗雅冬 2012年5月30 日星期三 • 实验流程： • 一、RNA 的提取 • 二、反转录（RT-PCR ） • 三、荧光定量PCR （qPCR ） • 四、数据分析 • 实验注意事项： 一、RNA 的提取 实验方法：异硫氰酸胍-酚-氯仿（三试剂）单步总RNA提取方法——Trizol法 实验所需试剂：推荐BIO-RAD 的AurumTM基于膜总RNA试剂盒 或PureZolTMRNA分离试剂 AurumTM总RNA小型试剂盒 PureZolTMRNA分离试剂 可以从广泛的样本，如培养细胞、细菌、酵母 PureZolTM RNA分离试剂操作是Chomczynski 动物和植物组织中，提取无DNA污染的总RNA 。试 和Sacchi的快速、广泛使用的有效RNA分离方法基 剂盒采用严格配比的含有异硫氰酸胍和巯基乙醇的试 础上改进而得。 PureZolTM RNA分离试剂是一种 剂，高效裂解样品并快速灭活RNA酶，然后通过离心 苯酚和促溶剂异硫氰酸胍的液相混合物，简单的 或抽真空对离心柱硅质膜上的RNA进行纯化。这个试 一步法就可以高效地完成细胞和组织溶解、去除 剂盒也可以用于RNA净化和脱盐。 RNA蛋白和灭活的内源核酸酶。DNA和蛋白通过 液相分层，有效地与RNA分离。 形式：小柱过滤（抽真空或离心） 形式：单一有机溶液 分离方法：硅质膜 分离方法：有机提取 * RNA提取实验结束后，请验证RNA 的纯度和完整性： 1、OD260/OD280=1.8～2.0 ，表示RNA质量好，没有蛋白和苯酚的污染。 2 、通过琼脂糖凝胶电泳来验证RNA是否降解 二、反转录 实验所需试剂：推荐BIO-RAD iScript cDNA Synthesis Kit 该试剂盒组成 优化好的5 ×iScript反应混合液Mix 除RNA模板以外所需所有成分的反转录酶混合液 缓冲液 纯化的iScript RNase H加MMLV反转录酶 Oligo(dT) 防止RNA模板非选择性降解的RNase抑制剂 随机引物 dNTP 稳定剂和增强剂 iScript cDNA 合成试剂盒的特点 ★试剂中既有 oligo(dT)，也有随机引物——保证各种RNA模板均能正常反应 ★预混的优化好的组分——使操作非常便捷，减少了交叉污染，也减少了操作误差， 节约了时间 ★优化的反应条件，高的反转录效率，宽的RNA模板范围——100fg-1ug ★带有高活性的iScript RNaseH+MMLV反转录酶和用于保护RNA模板的RNase抑制剂 ，满足不同用户需求 ★ Sensitive detection from 1 pg to 1mg of input RNA iScript cDNA 合成试剂盒——试剂成分比较 iScript cDNA Synthesis Kit，BIO-RAD SuperScript II First-Strand Sy