高等生物化学 第三章蛋白质分离纯化与表征.pdf

第三章 蛋白质的分离纯化与表征 蛋白质分离纯化的一般原则 总目标：增加蛋白质含量与生物活性， 除去不必要的杂质蛋白； 前处理：细胞破碎 粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机 溶剂沉淀等 细分级分离：层析、电泳、结晶 沉淀法 • 沉淀法也称溶解度法。 • 其纯化生物大分子的基本原理是： – 根据各种物质结构的差异来改变溶液的某些性质，就 能致使抽提液中有效成分溶解度的变化。 • 则可通过选择适当的抽提溶剂使欲分离的有效成分最 大溶解，而杂质最小溶解；或者相反。从而达到分离 的目的。 1. 盐析法 • 原理： – 根基蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高 而上升 （盐溶） – 但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降， 直至蛋白质析出 （盐析）。 2013/11/9 南京农业大学 生命科学学院 5 2013/11/9 南京农业大学 生命科学学院 6 1. 盐析法 • 盐的选择 – 一般蛋白沉淀时选用硫酸铵，原因： • 溶解度大，对温度不敏感 • 分级效果好 • 有稳定蛋白质结构的作用 • 价格低廉，废液可以肥田 – 盐析的缺点：样品继续纯化时须脱盐。 • 硫酸铵的缺点是铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白 质的定性分析造成一定困难。 1. 盐析法 • 硫酸铵盐析 – 固体法。在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵， 当达到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀下来。 – 饱和溶液法。较固体法温和，但不适用于大体积样品， 会导致样品体积大量增加。 – 透析法。将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大 体积盐溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐 浓度。该法盐浓度以连续状态变化，避免局部盐浓度 过高的不良影响，分级效果好。但受透析袋容积、盐 析速度、及硫酸铵耗费大的制约，仅用于精确、样品 体积小的试验中。 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 1. 盐析法 • 盐析的影响因子： ① 蛋白质浓度对盐析的影响：一般控制样品液蛋白浓度 在0.2%-2%为宜。 ② 离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大， 蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半 径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径 大而价数低的离子对盐析影响弱。 • 盐析的影响因子： ③ ＰＨ对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶 解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。 ④ 温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定 范围内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加； 但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一 般情况下在０~ ４℃操作。 ⑤ 其他：在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加入 一定量EDTA，以除去沉淀剂中带入的金属离子。 再者是加硫酸铵的时间要控制好，一般2h左右。 2. 有机溶剂沉淀法 • 原理： – 有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、 多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。 – 有机溶剂的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数从 而增强分子之间的相互作用，使其溶解度降低。 – 对于具有表面水层的生物大分子来说，有机溶剂可 破坏溶质分子表面的水膜，使这些大分子脱水而相 互聚集析出。不同溶质要求不同浓度的有机溶剂， 因此可用有机溶剂进行分步沉淀。 2013/11/9 南京农业大学 生命科学学院