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pET原核表达系统 一、基因表达系统 • 随着分子生物学研究不断深入，人们已经研究开发出 多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。 • 现有外源基因表达系统主要包括: 大肠杆菌、枯草芽 孢杆菌、链霉菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫杆状病 毒、动物乳腺生物反应器及植物表达系统等。 • 大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、 可以高效表达不同外源基因产物等特点, 是许多外源 基因表达系统中最好的一种。 外源基因在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 外源基因在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 二、基因表达方式 • 根据生物对内外环境刺激的反应，将 基因表达的方式分为： 组成型表达 诱导或阻遏型表达 协同表达 组成型表达（constitutive gene expression ） • 在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行 的基因表达，无论表达的水平高或低，它受环境因素 的影响较少、或变化很小。且基因表达产物通常是对 生命过程必需的、必不可少的，这类基因通常被称为 持家基因（housekeeping gene）。 • 举例： Homo sapiens ribosomal protein S27a (RPS27A),mRNA4156 Homo sapiens actin, beta (ACTB), mRNA6988 Homo sapiens lactate dehydrogenase A (LDHA), mRNA2105 诱导和阻遏表达（Induction Repression） • 诱导（induction）：在特定的环境信号刺激下，相应基因被 激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导 （induction）。 举例：lac操纵子 • 阻遏（repression）：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑 制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。 可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression）。 举例：trp操纵子 协调表达（coordinate expression ） • 在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表 达方式，均需协调一致、共同表达，使各表达产物的分子比例 适当，从而正常发挥功能。 三、乳糖操纵子结构 质粒图谱及质粒构建 启动子 外源基因 终止子 启动子报告基因 终止子 （标记基因） 目的片段 选择标记 载体 表达载体(expressing vector) • 特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列 • 大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克 隆位点—转录终止信号 – 启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体P 启动子、T7噬菌体 L 启动子 – 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码 子(ATG)和SD序列 – 转录终止序列 四、pET原核表达系统概况 • pET系统是有史以来在E.coli