Sanger法测序-20130701培训.pdf

Sanger法测序 单基因疾病产品开发 楚玉星 chuyuxing@genomics.cn Outline DNA测序概述 Sanger法测序原理 Sanger法自动化-ABI3730XL Sanger法应用举例 DNA测序概述 定义： *基因是遗传信息的物理和功能单位，含有产生 一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列，即 一段DNA序列 *基因的不同，是其碱基组成和排列顺序的不同 *用一定的方法测定并分析靶基因的碱基组成和排 列顺序（即DNA的一级结构）即为DNA测序 DNA测序概述 DNA测序的意义： 该技术是现代分子生物学中的一项重要技术 测序是进一步研究基因的功能、基因结构与功能关 系的基础 在临床，可为疾病的分子诊断提供最精确的判定依 据 （可以提供序列资料的分子诊断是分子诊断的黄金 标准） DNA测序概述 测序技术发展 Outline DNA测序概述 Sanger法测序原理 Sanger法自动化-ABI3730XL Sanger法应用举例 5´端 C 双脱氧链末端终止法 （sanger法） 【1977；Fred Sanger 】 测序原理： （1）DNA合成 A 在DNA聚合酶催化 下，前一个核苷酸的 3’-OH与再接上来的一 个核苷酸的5’-P之间 形成3 , 5  -磷酸二 G 酯键，从而连接形成多 核苷酸链 3 ´端 Sanger法测序原理 （2）链合成的人为终止 链终止剂--双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 什么是ddNTP? 终止合成的原理？ (3)试想，如在DNA合成体系中，加入少量ddNTP，会 出现什么结果？ 加入的ddNTP会与其相应的dNTP之间展开竞争，竞争着被参 入正在延伸的DNA链中；结果，两者随机参入链中相应位置 当dNTP参入， 则链继续延伸 当ddNTP参入，则链延伸终止 形成一系列长短不一的多核苷酸链，特点： **起点相同--引物 **尾—不同，是特异的相应的碱基 **长度各一：长度由待测序列的碱基顺序决定 （4）测序时，每个反应体系的组成 DNA聚合酶 单链DNA模板（待测片段） 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 原料-dNTPs(dATP,dGTP,dCTP和dTTP) 终止剂-ddNTPs(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) 反应分为四个独立的反应体系，每个反应体系加入四种 dNTP和其中一种ddNTP （5）在四组独立的DNA合成体系中,分别产生四组 以各自特异的ddNTP为末端、长短不一的多核苷酸 链 （6）通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离:其可区分长度差一个核苷酸的单链DNA （7）放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按 5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模 板链的序列 Sanger 双脱氧 测