大肠杆菌表达系统-3.pdf

第三章 真核基因在大肠杆菌中的表达 前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以 及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的 大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表 达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因 表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达 产物。 第一节 基因的表达系统与表达策略 最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌 等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 一、真核基因的大肠杆菌表达体系 目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系 统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆 虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大 肠杆菌表达系统具有明显的优越性。 大肠杆菌表达体系的优越性： 1. 对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序），特别 是基因表达调控的分子机理有深刻的了解（乳糖操纵 子）； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄 主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实有效、 高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批 量生产。 大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2.真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA 聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能 含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA 的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性。 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细 胞中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质 分子，并把它们降解掉。 6. 大肠杆菌周质内存在各种内毒素。 克隆基因正确表达的基本条件 能够进行正常的转录和翻译，以及在 正常情况下还与翻译后加工及新生多肽 在细胞中的分布有关。 启动子、终止子以及正确读码框 （ORF）。 二、大肠杆菌的表达载体 1、大肠杆菌表达载体的基本成分 RBS R P SD 编码序列 TT tetr Ori -35 -10 ATG （91% ） TAA 17 TTGACA 。。。。。TATAAT GTG （8% ） TGA TTG （1%） TAG TAAGGAGG （N ） 8 RBS：ribosome binding site, 核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 • 启动子 转录水平 • 终止子 • 核糖体结合位点 翻译水平 • 密码子 • 质粒拷贝数