工具酶和载体.pdf

第一节 工具酶和载体 （一）分子克隆（molecular clone ） 克隆的概念： 作名词用 遗传相似的群体 作动词用 无性繁殖 分子克隆的概念： 在分子水平上，使一个独特的DNA序列在细 胞中进行复制和表达。 分子克隆同义概念： • DNA重组技术(recombinant DNA technique) • 基因克隆（gene cloning ） • 基因操作（gene manipulation ） • 基因工程（gene engineering ） • 遗传工程（genetic engineering ） 分子克隆基本过程： 将生物某个有利基因从其基因组中取下来，与另一 个载体DNA缝合成为重组DNA 。然后，把这个重组 DNA安置到一个受体细胞中，使其安家落户。这个基因 在载体DNA 的带动之下，繁衍生息，生产出需要的基因 工程产品。 分子克隆的特点： 1. 打破物种界限，不同种类生物的遗传物质组合 在一起 2. 可以定向的改变生物的遗传特性 3. 高效增加目的基因的产量 （二）基因工程的工具酶 “手术刀” 专司切割之职 内切酶 “缝纫针” 具有连接之功 连接酶 “复印机” 行使复制之责 聚合酶 “搬运工” 胸藏末端转移之方 转移酶 1. Ⅱ型限制性核酸内切酶： 识别与切割DNA链上特异性核苷酸序列； 识别序列一般具180℃旋转序列（回文序列）； 长度一般是4 －8个碱基（4个以下很少）。 • 对双链DNA 同时切割，产生不同形式的 切口: 1）形成平头末端（blunting ends ） 2 ）形成5 ˊ粘性末端（Cohesive ends） 3 ）形成3 ˊ粘性末端 平末端 5 ˊ粘性末端 3 ˊ粘性末端 • 同裂酶（isoschizomers) 识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割， 形成同样的末端的一组内切酶。 • 同尾酶（isocandamers) 来源不同，识别不同核苷酸靶序列； 但形成同样的末端。 2. 核酸外切酶 从DNA链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。 按3‘-5’方向催化单链或双链DNA ，自3‘-OH末端释放5’- 单核苷酸。 应用： 通过3‘-5’活性使双链DNA分子产生出单链区，可作为 DNA标记的引物，制备特异的放射性探针。 3. DNA连接酶 催化两条DNA单链相邻碱基之间形成磷酸二酯键。 作用：封闭DNA之间的缺口（nick ），即双链 DNA 的某一条链上两个相邻核苷酸间失去一个磷酸 二酯键出现的单链断裂； 不能封闭裂口（gap ），即双链DNA 的某一链上 失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。 分子克隆中的作用: 催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成 重组DNA分子。 粘性末端DNA片段的连接：容易 平末端DNA片段的连接：比较困难 4. DNA聚合酶 Pol II 催化合成DNA 的互补链; 在生长链的3‘ －OH末端同渗进来的核苷酸发生聚合反应。 具备条件： 四种脱氧核苷酸dNTPs (dATP d