植物病理学高级实验技术指导.pdf

植物病理学高级实验技术指导 （植物病理学专业研究生使用） 南京农业大学植保学院植物病理学系 2009-03 植物病理学实验技术 第一部分 真菌学实验技术 实验一 稻瘟病菌转化 （Transformation of Magnaporthe grisea ） 一．原生质体的制备（Protoplasting ） 1、活化菌株，接种菌丝块(2mm ×2mm)于 CM 平板上生长 6d 左右，菌落直径约 3cm， 菌株不宜太老，最好不要超过 12 d。 2 、切取直径约 3cm 的菌落，尽量切碎，置于约 100ml CM/5 ⅹYEG 的液体培养基 中（含 50ug/ml Amp ），28 ℃，150rpm，过夜。 3、往瓶中再加 50ml 左右液体培养基，最好含 Amp ，28 ℃ 150rpm 过夜视菌丝 生长情况，如果菌丝生长缓慢，可再加培养基，延长培养时间，但要尽量防止其变黑。 4 、收集菌丝，用四层擦镜纸过滤，无菌水冲洗两遍，用吸水纸将水稍吸干。无菌 水冲洗步骤可有可无。 5、将菌丝置于盛有 10-20ml 酶液（含 50ug/ml Amp ）的50ml 离心管中酶解。离心 管平躺，30℃ 60rpm 2-3h 。 酶解过程中应吸取菌液镜检，检查原生质体是否释放；酶液需现配现用，PH 值很 关键，需用低浓度（0.1M ）的NaOH 调 PH 至 5.8 。 * 以下步骤于4 ℃下完成，0.7M NaCl 溶液,1 ⅹSTC 先放于 4 ℃预冷。 6、取出酶解液，加少许 0.7M NaCl 溶液，轻轻摇晃，倒于三层擦镜纸过滤，用 0.7M NaCl 溶液轻轻冲洗 1-2 次，去残渣，收集滤液于 50ml 离心管中。 7、离心，3000rpm，4 ℃，10min。 8、小心弃上清，加 10-20ml1 ⅹSTC 悬浮，用剪去尖端的枪头轻轻吹打 离心， 3000rpm 4℃ 10min 。 9、重复步骤 8 两次。 10、加适量（约 300ul ）1 ⅹSTC 悬浮，计数，使原生质体终浓度为 108 个/ml ，分装 为 150ul/管。立即转化或保存于-70℃。最好立即转化，一般不保存。 二．转化（Transformation ） 1、将2ug DNA （5-10ul ）加于 150ul 原生质体中，轻轻混匀，室温静置 25min DNA 浓度需足够大，且要干净 2 、分2-3 次加 1mlPTC，轻轻混匀，室温静置25min 静置时间不宜过长，PTC 对原生质体会有毒性。加好后去解冻 TB3 固体培养基 3、把原生质体加到 10ml 左右熔化后冷却至 45 ℃-55℃的 TB3 固体培养基中（含 50ug/ml Amp ），轻轻混匀后倒入培养皿中28 ℃黑暗培养 24h 培养基温度越低越好，解冻后放于 45 ℃水浴中防止其凝固；培养基的量也可多加， 分倒于多个皿中。 4 、往培养皿中再倒入 10ml 含 300ug/ml HygromycinB 的TB3 固体培养基（最好含 50ug/ml Amp ） 5、28 ℃下黑暗培养 7-10d 后挑出转化子，一般 5d 后即可看出转化是否成功 6、在含 300ug/ml HygromycinB 的TB3 固体培养基上再次筛选验证转化子。 ◆注意事项： 原生质体非常脆弱，操作过程中动作要轻 溶液配制要精确，需用ddH O配制 2 器皿要绝对干净 三．所需试剂及培养基（Reagents and media ） 1、CM 培养基： 50ml 20 ⅹNitrate Salts* 1ml Trace Elements* 1