研究生细胞培养实验课.pdf

实验一: 鸡胚原代成纤维 实验一: 鸡胚原代成纤维 细胞的制备与培养 细胞的制备与培养 一、 验目的 掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的 基本步骤； 掌握活细胞的显微镜下观察； 熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。 二、 验原理 离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化） 形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温 度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养 条 ，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培 养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如 肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等。 通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一 次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。 原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环 境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖， 药物的作用机制等的研究。 三、实验材料 （2人/组） 9～11 日龄鸡胚1只，碘酒和酒精棉球若 干，无菌器械一套，无菌无毒平皿2只； 5或10ml吸管4支，1或5ml吸管1支，长青 霉素瓶2只 （带塞）； Hank s液1瓶，RPMI-1640或DMEM 1瓶， 双 1瓶 （5ml）； 胰蛋白酶1瓶 （1ml），血清1瓶 （5ml）， 5.6 ％NaHCO3 1瓶 四、操作步骤 1、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵 壳； 2、取出两只无菌平皿，并标记①和②，待 用。 3、在RPMI-1640和Hank s 液中分别无菌 操作以1％的量加入双 ，吸出10～15ml Hank s 液至无菌平皿中备用； 4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室 外卵壳； 5、消毒镊子后小心撕破卵膜，两人互相配合取出 鸡胚置于盛有Hank s 液的平皿①中，小心去头、 内脏、爪和粘液及血球，洗涤后置于盛有Hank s 液的平皿②中，再充分洗涤； 6、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中，在火焰 3 附近用无菌眼科剪刀将其剪成约0.5～1mm 的小 块 （约250次），此时体积约0.5ml；用Hank s液 洗涤两次。 7、加入1 ml 1％胰蛋白酶，用适量Hank s液调 整使其工作浓度为0.25 ％，5.6％NaHCO 调节pH 3 至约7.3～8.0 （肉眼观为肉红色，1 ml吸管约3滴） 盖上瓶塞，写好标记； 8、将上述细胞瓶置于37℃水浴中，开始计时， 约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。消化 停止的标志是：轻轻晃动后细胞悬起，呈云雾 状，很快聚集成团，表明细胞活力好。 9、消化结束后，取出，稍沉淀，缓慢吸出上清， 用Hank s 液小心洗涤2～3次，可以尽量减少胰 蛋白酶的残留量，然后加入RPMI-1640液约 5ml，用小头吸管充分吹打，使细胞充分分散。 吸上清；重复操作3～4次，收集细胞上清。 10、上述细胞悬液自然沉降，待未消化彻底的组 织块沉入瓶底后，收集上清，并加入足量的小牛 血清 （终浓度为10％）。 11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到 两个细胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注 意生长面朝下，在非生长面上做好标记， 包括细胞名称，接种培养时间，组别及姓 名等。 12、细胞统一置于本室指定的37℃，5％ CO 孵箱中培养。 2 13、24h后观察细胞生长情况，如果细胞长 成单层，细胞界限清晰，大多数细胞为梭 形并贴壁，布满细胞瓶的生长面，说明细 胞生长状态良好。 实验二: 滤泡性口炎病毒 实验二: 滤泡性口炎病毒 （VSV ）的增殖（纯培养） （VSV ）的增殖（纯培养） 一、 验目的 掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。 二、 验原理 原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环 境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖， 药物的作用机制等研究。病毒在细胞内增殖的检 测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、 干扰现象、免疫荧光法检测等。由病毒引起的细 胞病变称细胞病变效应 （cytopathic effect， C