近端肾小管上皮细胞1α羟化酶表达地调节与其对成骨细胞地影响.pdf

近端肾小管上发缅瞧lC／羟化酶表达的渭节及其对成骨细胞的影响 第一部分 第一部分近端肾小管上皮细胞原代培养、鉴定与生物学功能检测 材料与方法 一、实验材料 (～)主要试剂：(带木试剂配制方法见附录) RPMll640培养基干粉：GIBCOBRLU．S．A： BRL U．S．A； 胎牛血清(FCS)：GIBCO 青霉素：上海第二制药厂； 链霉素：上海第四制药厂； 碳酸氢钠：上海虹光化工厂； 磷酸氢二钠：上海新华化工厂； 磷酸二氢钾；上海试剂二厂； 胰蛋白酶：Sigma公司； 胰岛素：上海华美生物工程有限公司； 转铁蛋白：上海华美生物工程有限公司： 亚硒酸钠：上海新华化工厂； 氢化可的松：Sigma公司： 三碘甲腺原安酸：Sigma公司； 表皮生长因子：上海普飞生物技术有限公司； ALP染色试剂盒：华美生物工程公司： 二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)：上海思吉生物制品有限公司 十二烷基硫酸钠(SDS)：上海思吉生物制品有限公司； 25(OH)D3：上海普飞生物技术有限公司； 1 d，25(OH)2D3：上海普飞生物技术有限公司； HPLC级甲醇：上海实生细胞生物技术有限公司； *PBS缓冲液： *RPMll640培养液： *20％SDS溶液： $O．25％胰蛋白酶消化液： (二)主要器械与仪器 二氧化碳培养箱，环流热空气消毒箱：Heraeus，Germany； 倒置相差显微镜：Olympus，Japan； 透射电镜：PHILIPSCM一120透射电镜； 6 近端臀夺管￡皮细胞la羟化酶表达的调节及其对成骨细瞻的影响 第一部分 扫描电镜：S-520日立Japan； 光学显微镜：Nikontype102，Japan； 超净工作台：上海净化设备厂； 万分之一电子天平：Sartorius 2004型Germany； Elx800 酶标仪：Bio—Tck U．S．A．： 恒温水浴箱：HWC．51上海第二天平仪器厂； Waters600E四元梯度泵／2487紫外监测器：WATERS。U．S．A： KromasilC18 250x4．6rm色谱柱：上海安谱科学仪器有限公司； 80目、100目不锈钢网：上海实生细胞生物技术有限公司； 培养瓶／板：NUNCDenmark； 抽滤器，压力泵等。 (三)实验动物 1月龄SD大鼠，体重100±139，复旦大学放射医学研究所实验动物部供应。 合格证：SCXK(沪)2003--0004。 二、实验方法 (一)原代近端肾小管上皮细胞分离培养和生长曲线绘制 肾小管节段的分离：大鼠试验前12h禁食，自由进水。22％乌拉坦麻醉，无菌取 肾，去肾包膜，将肾胀纵行切开，分离肾皮质，并将其剪成lmm3小块，PBS缓冲液冲 沈3遍，置80目不锈钢筛网上轻轻研磨并以PBS缓冲液充分冲洗，于100目筛网上 收集肾小管节段(过筛后小管纯度可达90％)，1000rpm离心5min。 肾小管节段的消化和培养：取上述离心沉淀，加0．25％胰蛋白酶3ml，充分吹打 g／m]，转 铁蛋白5u 养板内，置37℃、5％C晚培养箱培养，72h首次换液，之后隔天换液。 生长曲线绘制：第2天、第3天、第5天、第7天、第10天分别取一96孔培养 板细胞作MTT测定。方法：弃培养上清夜，每孔加入无血清RPMll640培养液 100ul，MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)10u1，37℃孵育4h，加入20％的SDS(十二 烷基硫酸钠)150u 数为横坐标，以0D值为纵坐标绘制生长曲线。重复实验3次。 7 近端肾小管上皮缅跪ld羟化酶表达的诵节及其对戒骨镪髓的影响