抗早熟药对青春期大鼠生长发育地影响与机理.pdf

究，探讨这两种抗早熟药物影响生长发育的作用途径与机制。 材料与方法 1材料 1 1药物 中药滋阴泻火方：生地、知母、丹皮、泽泻、黄柏、炙龟板等，100ml／@自 生药2．6 g／ml。由上海复旦大学附属儿科医院中药制剂室负责制备。 系法国PharmaBiotech公司产品，3．75 mg／3￡。 1 2试剂 1．21 TRIzol Reagent为美国GIBCO公司产品： 1．2．2 l 23逆转录酶MMLV为美国GIBCO公司产品： 1 2．4 KNasin(KNA酶抑NN)购于上海华美生物工程公司； 1 2．5 DNA聚合酶(5 Taq U／91)购于上海华美生物工程公司； l 2,63SDNAGelPurificationKitV31试剂盒由上海博彩生物公司提供； Green 1，2．7荧光染料SYBR I由德国Roche公司生产； 1．2．8ACTIVE RAT IGF．1试剂盒为美国DSL公司产品。 1 3仪器及耗材 1 31低温高速离心机GS．15R为美国BECKMAN公司产品： 1 3．2法国吉尔森移液器(2¨1、20“I、100pl及1000“1)； 1 33 Eppendorf管均为RNase Free，为美国Axygen公司产品； 1 3．4 UV-1601紫外分光光度仪为日本SHIMADZU产品； l 3．5 PCR仪GeneAmpPCRSystem2400为美国应用公司产品； 1 3 7000 PRISM Detection 6荧光定量PCR仪ABI Sequence System为美国应用 公司产品； 1 3．7酶标仪为Finland Labsystems Dragon。 2方法 21实验动物与分组 选取清洁级SD大鼠150只，雌性，4周龄(相当于青春早期)∞】，平均体 重7卜80克，购买并饲养于复旦大学实验动物中心。实验动物随机分为5组， 每组30只大鼠： A组为空白对照组，灌喂生理盐水，2ml／只／天； B组为小剂量滋阴泻火中药组，喂饲中药1 mWlOOg体重，天： C组为中剂量滋阴泻火中药组，喂饲中药2 ml／1009体重／天； D组为大剂量滋阴泻火中药组，喂饲中药4 mt／1009体重／天；其中中剂量 中药相当于I临床中所用剂量，根据中药药理学研究方法进行换算阳】；共喂药八 周(从4周龄喂至12周龄)，之后停药四周(即至16周龄)； 1 E组为达菲林注射组，0mg／1009体重／次【261，每三周注射一次，共三次， 给药时点为4周龄、7周龄和10周龄。 2．2生长发育指标观测 自大鼠4周龄起，每周观测其身长(用游标卡尺测量从鼻尖到尾根部长度)、 体重和阴道口开启情况至实验结束(即大鼠16周龄)，处死动物时测量下肢胫 骨长度。 23标本取材 在喂药四周、八周及停药四周时，每组随机抓取10只大鼠，腹腔注射10％ 水合氯醛03ml／lOOg体重麻醉后，断头取血，待血凝固后，放入水平离心机3000 ml 转离心10分钟，吸取上清至1．5Eppendorf管，．20。C保存待用；留取下丘脑、 垂体、肝脏、卵巢、双下肢骺软骨标本，保存于液氮中。 24组织RNA抽提