慢性间断性缺氧对小鼠肾脏结构与基质金属蛋白酶-1、8、9与其组织抑制因子-1地影响.pdf

l 4 个，i模拟列照系统：其控制系统与间断性缺氧系统共用，但供应的气体为空气。 6500空气泵提供。 带例箝悯侧断性缺氧系统。所有气源均由Atman 2 ’3、≥、j “ 2．1实验动物分绷 g gI．川断缺氰八剧fk[10H(体重(27 H小鼠的削断缺氧实验，四周后加入5只小鼠进行间断缺氧四周实验，六周后再加入5 ¨小鼠进行问断缺氧二周组实验。每同8：00至16：Oo时实验组小鼠置于间断缺氧系 统的衔闭箱小绎／力川断缺氧， 16：00时以后使小敝生活于大气环境中；10只空气对 J内，。静jj窄’L模拟剥照系统的密闭箱中进行实验。1艾验过程 1i吲川、沁≈K川H的时m Il＼I。。ij 2．2 慢性IHj断性小鼠模型的制作 将氧浓度测量仪置于密闭箱内，开启控制器，在氧浓度测量仪的监测下，通过控制 ¨序搜改定各种。t体的吹入时问及流量，调控箱内氧浓度。使得每‘删I：t断性缺氧循环时 jj秒。箱内氧浓度由氧气检测报警仪读出，汜录30个循环的最高氧浓度及最低氧浓度。 每隔j秒池求箱内的氧浓度‘次，连续记录5个循环，驭平均值，作循环中箱内氧浓度变 化趋势例。将小鼠吲定于二缺氧箱内，使其心脏贴近操作孔(1IJ透明薄膜封闭)，丌启挎 m0器，“础川断性缺氧循环。在不同的缺氧循环时刻，经操作孔穿刺小鼠心脏，抽墩左 ，L、7锄[【L液标本，川付记求由氧气监测报警仪读出的箱内即时氧浓度及控制器所示循环时 ㈨将抓小、j圳送m气分析，取得血氧饱和度、血氧分压、血二氧化碳分压等数掘。分 析箱内氧浓度变化与小鼠左心血氧分压及血氧饱和度相关性；阱循环时削为横坐标，动 咻|f||々rL饱制度、mI氧分压及动脉一二氧化碳分压为纵坐标做出各种指标在缺氧循环中变化 ¨冉。 2．3 -以十．j 八周实验结束后，所有30只小鼠同时伯J取材。取材步骤：捉取小鼠，暴露腹部， 用0．2％戊巴比妥溶液，按50mg／kg进行腹腔麻醉，后固定小鼠于操作台，沿腹IF中线开 腹以减，步141,ifii，扪丌腹腔后小心暴露肾脏，剪断肾蒂，取出完整肾脏置10％甲醛溶液中 ”】疋 所自小瞰均顺利墩得肾脏标本。 2．4 免疫组织化学实验 2．4．1小鼠肾脏!,IMP—l免疫组织化学实验步骤如下： I．将甲醛到定的小鼠肾脏标本，按常规制成4“m厚的石蜡切片，使用多聚赖氨酸作为 ∞脱”剂，笄蓠158～60℃烤箱2小时，使切片紧密粘刚。 2．常胤脱蜡年水。 3．．j矧h0．上离，水‘书渴孵育30分钟，灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次。 4 ：阿汁入1nlMI!D 7rA抗原修复液(PH8．0)烧杯放入装有适量水的不锈钢锅中加热至沸 嘴。…1酣J戟玻片染色柴上，浸入抗原修复液中，使切片位于液向n盖锅压阀。当 一叫J俐Ji：始慢慢喷。i时(约加热5-6分钟后)，计时2分钟，然后将压力锅端离热源， ‘’i湍冷刨lj分钊}，舣i-h烧杯。 5．训片自然冷卸至室温，蒸馏水清洗后，PBS洗2分钟3次。 1uc敞箱过仅。ms洗2分钟3次。 7 以㈨s代倚抗作为劂性对照。 8．滴女叫J#抗兔JgG抗体_HRP多聚体， 37。C温箱孵育30分钟。PBS洗2分钟3次。 }i_|二纠』_i枷午圳／扎宅潍显色，镜]；控制反应剥‘削。 I(J．，传馏水龟分¨t泌。 1 1．一臻水熏轻度复染4min。脱水，透明，中性树胶封片。显微镜下观察。 Ⅵ¨一1]-q-I性判断标准：MMP～l为细胞浆着色，有棕黄色染色者为阳性细胞㈨。 ‘诞验过槲l{I，30张标本片同期进行免疫组织化学实验步骤，DAB显包时间保持一致 “，，一0战少’艾蟛l4’i内跌茬。 2 4．2 小鼠肾朋MMP L。9及7HMP—l ‘J∞L分圳为1：75稀释t稀释度经已知阳性片预实验得出j的MM[。8、MM 抗(免抗l g(；)，其它步骤与MMP—l相同。 M9及TJMP—l阳性判断标准：MMP一9及7PIMP一1为细胞胞浆着色，有浅黄、棕 曲、数褐包