2014研究生自开课-免疫电镜.pdf

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2014研究生自开课-免疫电镜

工作原理: 用一束极细的电子束扫描样 品,在样品表面激发出次级电子, 次级电子的多少与电子束入射角有 关,也就是说与样品的表面结构有 关。次级电子由探测体收集,并转 变为光信号,再经光电倍增管和放 大器转变为电信号来控制荧光屏上 电子束的强度,显示出与电子束同 步的扫描图像。图像为立体形象, 反映了标本的表面结构。 工作原理: 由电子枪发射出来的电子束,在真空 通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜,通过聚 光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀 的光斑,照射在样品室内的样品上;透过 样品后的电子束携带有样品内部的结构信 息,样品内致密处透过的电子量少,稀疏 处透过的电子量多;电子束经过多级综合 放大成像,最终被放大了的电子影像投射 在观察室内的荧光屏板上,并转化为可见 光影像以供使用者观察。 镜筒 真空装置 电源柜  普通透射电镜 观察组织的一般超微结构。  免疫电镜 观察某种特定抗体标记阳性的细胞或细胞的 某一部分如细胞器的超微结构。  免疫电镜技术(immunoelectron microscopy, IEM) : 运用免疫组织化学的基本原理,即抗原和抗体特异 性结合的原理,利用电子显微技术,在超微水平上 定位、定性以及半定量抗原的技术方法。 组织硬 包埋剂支撑 如何切这么薄? 刀锋利 钻石刀 组织标本经过固定和树脂包埋,做成超薄切 片后,再进行免疫组化染色。优点是超微结构保 存较好,方法简便。缺点是抗原在脱水、浸透及 树脂包埋过程中可能被破坏,且抗原被树脂遮盖 不易与抗体接触,使免疫标记的阳性率下降。尤 其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重,因此常 常避免使用。 先进行免疫染色,而后进行常规电镜方法处理。 优点: ⅰ.切片在免疫染色前不经过后固定、脱水及树 脂包埋的过程,抗原未被破坏,易于获得良好的免 疫反应; 先进行免疫染色,而后进行常规电镜方法处理。 优点: ⅱ. 在标记完抗原后,再经过戊二醛交联和锇 酸后固定,有利于膜结构的维持,而且抗原抗体被 更牢固的结合在一起,提高标记率; 先进行免疫染色,而后进行常规电镜方法处理。 优点: ⅲ.可在免疫反应阳性部位定位做超薄切片,提 高电镜下的检出率。 透射电镜分辨率为0.1 ~0.2nm ,可放大几万~几十万倍。 适用于细胞膜表面抗原的定位,由于其分子量较大, 不易穿透细胞膜,定位细胞内抗原较为困难。 是将酶(主要是过氧化物酶)与抗体相交联,抗原 抗体反应后,加底物显示酶的活性部位,酶反应产 物经O O (四氧化锇,锇酸)处理变为具有一定电 s 4 子密度的锇黑,可在电镜下观察。过氧化物酶的相 对分子量较小,与其交联的抗体较易穿透经处理的 细胞膜,可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产 物比较弥散,因此分辨率不如颗粒性标记物高。 目前应用最广的免疫电镜标记技术,该技术是将胶体金作为 抗体的标记物,用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。  1.胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白,而且蛋白的生 物活性不发生明显改变;  2.在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰, 易于辨认,定位比酶反应物更精确;  3.胶体金标记物易于制备,并可以根据需要制备大 小不同(1~150nm)的胶体金,因此可进行免疫电 镜的双重或多重标记;  4.金颗粒能发射强烈的二次电子,是扫描电镜的理 想标记物;  5.胶体金经过银显影增强后,金颗粒外周吸附大量 银颗粒而呈现黑色或黑褐色,因此也能用于光学显 微镜观察。 固定——固定剂的选择  甲醛对组织渗透力强,固定迅速,起着暂时固定的作用。苦 味酸对膜性结构有较好的固定作用。戊二醛固定速度快,可 固定蛋白质、碳水化合物、糖原、糖蛋白等,且可以保存某 些酶的活性,但难以保存脂类,而且对膜结构有一定的交联 作用。  实验动物经主动脉依次

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