原位杂交试验方法.ppt

原位杂交实验方法 mRNA 原位杂交前实验准备 1，无RNA酶水的处理 2，无RNA酶载玻片的处理 3，标本的防RNA酶的固定 4，探针的稀释和保存 5，DNA探针需变性 原位杂交溶液的配制 1，预杂交液和杂交液的配制 2，20Xssc， 2Xssc， 0.2Xssc缓冲液的配制 3，0.1mol PBS缓冲液的配制 4，0.1mol 枸橼酸缓冲液的配制 5，0.1mol TBS缓冲液的配制 6，复合消化液的配制 7，组织细胞打孔液的配制 8，杂交漂洗液 9，过氧化氢封闭液 探针设计方案 1，探针名称 ： 2，适用种属： 3，标记方式：3ˋDIG 5ˋFAM 4，模板序列： 5，探针序列： 探针杂交原理 1，组织细胞的通透 2，探针长度 3 , 探针浓度和杂交时间 4，杂交中的Tm值和杂交温度 5，杂交严格度 6，预杂交原理 7，杂交后处理 A-石蜡切片mRNA原位杂交步骤 一，过氧化物酶显色系统 二，碱性磷酸酶显色系统 三，荧光显色方法 B-冰冻切片mRNA原位杂交步骤 一，过氧化物酶显色系统 二，碱性磷酸酶显色系统 三，荧光显色方法 C-细胞爬片或涂片mRNA原位杂交步骤 一，过氧化物酶显色系统 二，碱性磷酸酶显色系统 三，荧光显色方法 附录 1，DAB的配制和使用方法 2 NBT/BCIP的配制和使用方法 3，苏木素的配制和使用方法 4，核固红的配制和使用方法 流式细胞仪 D-悬浮细胞的mRNA原位杂交细胞流式细胞仪步骤 * * 适用方法 荧光检测系统 过氧化物酶检测系统 碱性磷酸酶检测系统 石蜡切片 冰冻切片 细胞涂片和 细胞爬片 原理： FISH—Cellscience设计的原位杂交，用以显示组织和细胞中mRNA的分布。探针的3，端标记地高辛，5’端标记荧光素。生物素标记的抗地高辛抗体可以与链霉亲和素标记的过氧化物酶或碱性磷酸酶结合，作用于相应的显色底物DAB或NBT/BCIP，显色为棕黄色或蓝紫色，探针5，端标记的荧光素，可以在荧光显微镜492-549nm时发出黄绿色荧光来显示被检测mRNA之信号。此方法的灵敏度可基本上替代放射同位素标记的探针且具有低背景和操作简便的优点。也可以用于Northern和Southern的检测以及原位PCR 。 所用试剂准备： 1 两端标记寡核苷酸 探针 干粉 Product Number: nFISH 30ug 2 寡核苷酸 探针稀释液 既用型 Product Number:FISH001 2ml 3 寡核苷酸探针预杂交液 既用型 Product Number:FISH002 2ml 4 复合消化液 (P/E)PH:6.4 既用型 Product Number:TSP6044 6ml 5 生物素标记的小鼠抗地高辛 浓缩型 Product Number:DB7405B 0.1ml 6 高敏过氧化物酶链亲和素复合物 浓缩型 Product Number:AA7419H 0.1ml 7 DEPC Product Number:D5758 10ml 8 DAB Kit Product Number:D5637 3ml 9 20 X SSC 干粉 1000ml 1， 无RNA酶水的处理：1000ml 去离子水中加入1ml的DEPC（注：DEPC加入水中时应为油珠 状，此时才能有效灭活RNA酶）37度搅拌24小时以灭活RNA酶，然后高压消毒降DEPC， 备用。（此水为无RNA酶水用以配制原位杂交时所用的溶液。