试验一酶催化蔗糖转化反应（~28学时）.doc

实验一 酶催化蔗糖转化反应（~28学时） 目的和要求 用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。 了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。 学会米氏常数的测定。 实验原理 蔗糖转化反应 蔗糖 ＋ 水 ——→ 葡萄糖 ＋ 果糖 这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。 溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度(与反应物浓度C成线形关系，即 (＝kC 作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成物的葡萄糖也是右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为－91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到最大值。 仪器和试剂 旋光仪1台 恒温槽1套 葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯） 醋酸－醋酸钠缓冲溶液 实验步骤 蔗糖酶的提取 取鲜酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，搅拌15～20分钟后使团块液化，再加3 mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37℃保温60小时左右。取出后加入3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右。将混合物以每分钟3000转的速度离心30分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，再以同样速度离心30分钟，所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品。将此蔗糖酶用pH＝4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存。 作蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线 根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为： y＝－60.28x＋( 其中 x－蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M） y－蔗糖转化进程中体系的旋光度值 (－不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算。 (＝66.6×L×C （L＝10cm，C是蔗糖浓度g/mL） 通过上述的直线方程，可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值，求出其转化成葡萄糖的浓度x，从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度。 酶比活性的测定 配制2.5％的蔗糖溶液100 mL，测定其旋光度。在20℃的条件下加入蔗糖酶5 mL，反应3分钟测定体系旋光度值y，用公式 y＝－60.28x＋( 求出葡萄糖浓度x，及生成葡萄糖的毫克数，即可求出酶的比活性。（上述方法制备的酶，其活性约每毫升20单位。） 比活性(单位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积) 蔗糖酶进程曲线的制作 取200 mL 0.1 M的蔗糖溶液，在35℃水浴条件下恒温，加10 mL蔗糖酶溶液，每5分钟取出20 mL反应液加5滴5 M NaOH灭活后，测定一次体系的旋光度。求出葡萄糖的浓度，用葡萄糖的浓度对时间作图，得到蔗糖酶催化反应的进程曲线。 时间（分） 5 10 15 20 25 30 35 40 旋光度 葡萄糖浓度 蔗糖酶米氏常数的测定 用缓冲溶液稀释0.5 M的蔗糖溶液成为一系列不同浓度的蔗糖溶液各50 mL，在35℃恒温条件下加入10 mL已知活性的蔗糖酶，反应5分钟，加入1 mL 5 M NaOH溶液终止反应，测定此时溶液的旋光度，从而求出葡萄糖的生成速度V，根据米氏方程 用反应速度V对（V/S）作图，直线的斜率-Km，直线的截距为Vmax，从而可以求出米氏常数Km。 加入蔗糖 体积(mL) 蔗糖浓度（M） 起始 旋光度 结束 旋光度 葡萄糖 浓度（M） 反应速度 V(M/分) V/S 1 1.20 0.01 2 3.60 0.03 3 7.20 0.06 4 10.8 0.09 5 14.4 0.12 6 18.0 0.15 7 21.6 0.18 8 25.2 0.21 数据处理 利用(3)中的数据计算酶的比活性。 利用(4)中的数据作酶催化反应进程曲线。 利用(5)中的数据计算蔗糖酶米氏常数。 六、参考文献 沈同等，“生物化学”，上册，人民教育出版社，1980年版。 复旦大学，“物理化学实验”，上