cDNA末端的快速扩增（RACE）.PPT

第一节　PCR扩增获得目的基因或cDNA 第二节　基因组文库的构建与基因分离 第三节　cDNA文库的构建与筛选 第四节　根据差异表达获得目的基因 第五节　基因的化学合成; 基因克隆的本质是把某一目的DNA片段通过无性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。 一般而言，基因克隆包括四部分工作： 1、目标DNA片段的获得； 2、克隆载体的构建； 3、寄主细胞的转化； 4、重组体克隆的选择和鉴定。 目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。;大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案;　PCR法定向扩增目的基因的基本原理 　　　PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序 　　　使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。;　基于PCR的分离法 　（1）直接从基因组中扩增 　　　提取基因组DNA作模板 　　　根据目的基因序列设计引物 　　　PCR扩增 　　　　　 　　　　　适合扩增原核生物基因。 　　　　真核生物基因组含有内含子！;原核基因组部分;　基于PCR的分离法 　（2）从mRNA中扩增: RT-PCR 　　　提取基因组 total RNA 　　　反转录合成总cDNA作模板 　　　根据目的基因序列设计引物 　　　PCR扩增 　　　　　适合扩增真核生物基因。 　原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。;;　基于PCR的分离法 　（3）同源序列克隆法 　依据： 　　　自然界的长期进化中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，在生物的种属之间，基因编码序列有着很高的同源性。 　方法： 　　　根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。;RACE：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3‘端和5’端进行克隆，可获得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意义）;1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列，测序。 　 2、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的3’端和5’端的扩增。 3、拼接成 cDNA全序列的信息，设计新的引物扩增全长cDNA序列。;　　 3’ RACE：由含有oligo（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3’引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3’末端序列。 5’ RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列，利用5’锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5‘末端序列。;由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA;3-RACE ;5’RACE;5-RACE