细胞转染技术Transfection.pdf

细胞转染技术 Contents 转染简介 • 概念 • 历史 • 转染技术分类 • 稳定转染细胞系构建 问题与解决方法 • 转染中常见问题 转染的概念 转染 Transfection (trans- and infection) 是 指将外源物质通过特定途径导入到细胞内部的过程。 转染的发展历史 1950s/1960s:Gene transfer •分子基础-双螺旋结构模型和中心法则的提出 •病毒侵染细胞的发现. Gene therapy 1970s: Virus •研究者开始关注影响转染效率的因素并寻找新的适合 DEAE-dextran 作为转染试剂的介质：pH (6.9-7.4), 孵育时间, 细胞密 度(60-90%), 转染试剂与DNA的比例。 Calcium phosphate 1980s-: Cationic liposomes Cationic polymers …… 转染技术分类 •生物转染 Biological-based transfection (Viral-based) •物理转染 Physical-based transfection •化学转染 Chemical-based transfection 转染技术分类 •生物转染 Biological-based transfection (Viral-based) •物理转染 Physical-based transfection •化学转染 Chemical-based transfection 生物转染方法病毒介导的转染（导）过程 Process of Viral-based Transfection • 以病毒作为载体，通过病毒感染的方式将DNA转入细胞中。 • 其中以逆转录病毒和腺病毒系统最为常用。 病毒种类 •RNA病毒（Retroviruses ）: synthesis dsDNA from ssRNA, integrated into host chromosomes. ▫ 鼠白血病病毒(MuLv, Murine leukemia virus) ▫ 人免疫缺陷病毒(HIV, Human immunodeficency virus) ▫ 人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV, Human T-cell lymphotropic virus) •DNA病毒（DNA viruses ）: a class of viruses with ssDNA or dsDNA genome ▫ 腺病毒(AV, Adenovirus, dsDNA genome). ▫ 单纯疱疹病毒(HSV, Herpes simplex virus, dsDNA genome) infect a particular cell type, neurons ▫ 腺病毒相关病毒(AAV, Adenovirus-associated virus, ssDNA genome) insert at a specific site on chromosome 19. ENV：包膜糖蛋白 HIV Genome GAG：基本元件 Pol：蛋白酶，逆转录酶，整合酶 水疱性口炎病毒 G蛋白VSVG 慢病毒载体——构建流程 不同病毒介导的转导特点 Viral vector DNA size Cell type Expression Pitfalls Retroviral 8kb Dividing Stable Random insertion cell