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引物primer-昆明医科大学
许冰莹, Tel:0871Email:bingying_xu@126.com 昆明医科大学法医学院 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 一种模拟人体DNA半保留复制原理,在体外扩 增特异性目的DNA片段的技术,经过PCR,可 在数小时内,使目的DNA片段获得百万个的拷 贝,便于后续的分析和检测。 DNA Denaturation(DNA变性) 通过加热(94 ℃ )使模板DNA双链间氢键断裂,双链解离形成两条单链DNA的过程。 DNA Annealing(DNA退火) 又称DNA复性,将反应体系降温(60 ℃ ),引物与单链模板DNA按照碱基互补配对的原则重新形成模板-引物杂化双链的过程。 DNA Extension(DNA延伸) DNA聚合酶在适当温度条件下(72℃)催化4中dNTP原料按照碱基互补配对原则从引物的3’末端开始渗入,延模板有5’?3’方向延伸,合成一条新的DNA链的过程。 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 例如IL-3 : 5‘GCTCCATGA---------TGAGTCCAA 3‘—正链 --ACTCAGGTT 5‘—负链 上游引物:与其5‘→3端的序列相同 5-GCT CCA TGA -3 下游引物: 相应互补链5→3序列相同 5-TTG GAC TCA -3‘ 靠近5’上游Primer与双链DNA正链相同,3’下 游Primer与负链相同。 1.变性温度与时间 一般93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性 ——若低于93℃则需延长时间 ——但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性 有影响。 此步若不能使靶基因模板完全变性,就会导致PCR失败。 2.退火(复性)温度与时间 取决于引物的长度、碱基组成(GC含量)及其浓度,还有靶序列的长度。 退火温度是影响PCR特异性的重要因素: 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 复性时间:一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合. 延伸温度:一般在70~75℃之间,常用温度为72℃。 此时TaqDNA聚合酶活性最高。 延伸时间:靶序列长度 1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min(足够) -扩增10Kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增。 对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。 预变性(93-95?C,2-5m) 变性(93-95?C,30s) 退火 (50-70?C,30s) 延伸(75?C,30-60s) 总延伸(75?C,7m) (25-35) PCR的一般过程: 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 *二.PCR反应体系 Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase ) 引物(primer) dNTP(A、T、C、G) 模板(template) Mg2+(PCR buffer) 标准的PCR反应体系( 100?l ) 4种dNTP混合物 各200 ?mol/L(A、C、T、G) 引物 各10~100pmol(上游引物、下游引物) 模板DNA 0.1~2 ?g Taq DNA聚合酶 2.5u 缓冲液 Mg2+ 1.5mmol/L KCl 50mmol/L Tris-HCl(Ph8.4) 10mmol/L 0.001%明胶或牛血清蛋白 What’s in the Tube Target DNA 5’ 3’ 3’ 5’ primers A B dNTP Taq DNA polymerase Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Buffer containing magnesium 1.Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 最适温度:72℃, 半衰期:92.5℃130min ;95℃ 40min ;97.5℃ 5—6min。 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。 1.Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶。 ①5’?3’DNA聚合酶活性; ②无3’?5’外切酶活性,没有引物3’ 端错配碱基的校正功能, 35轮循环有0.25%错配,与原始模板 有差别。 人工合成的寡核苷酸序列,与靶DNA片段两侧翼的序列互补。 引物序列限定了PCR产物的长度和特异性。引物浓度一般为0.1~ 0.5?m
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