抗原抗体的纯化专用课件.ppt

第三章 抗原抗体的纯化 广东药学院公共卫生学院 赵晓蓉 本章要求 掌握各种纯化方法的原理 熟悉各种纯化方法的影响因素 了解各种纯化方法的技术要点 免疫学检验最重要的元素为抗原、抗体和免疫细胞 免疫学检验最核心的部分为抗原抗体反应 (Antigen-antibody interaction) 抗原、抗体是免疫反应中最基本的物质因素 抗原的纯化是制备高效价、高特异性抗体的先决条件 抗体的纯化对提高免疫反应的特异性和敏感性、定量检测抗原极为重要。 第一节 离心分离法 离心分离已成为科学研究中最基本的技术 一、基本原理 离心法是利用旋转运动的离心力、物质的沉降系数和浮力密度的差别进行分离的技术，当物质 的粒子以一定角速度做圆周运动时，受到一个外向的离心力 。 （一）离心力 这种力的大小取决于角速度（ ，弧度/ ）和旋转半径，方程式为： （二）沉降系数 受离心力作用的分子或颗粒，单位时间内运动的距离称沉降速度。单位离心力作用下的沉降速度称沉降系数，用s表示。 绝大多数生物分子的沉降系数都很小，将s乘1013定义为一个沉降系数单位，用S（Svedberg）表示， 一般S为20℃的纯水中待测物质的沉降系数。 二、离心方法的类型 （一）差速离心 （differential centrifugation）是指采用不同的离心速度和离心时间，用不同的离心力，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。 差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 差速离心法分离到的某一沉降物，纯度不高，含有较多杂质。 需在沉淀中加入相同介质使沉淀悬浮，再用较低转速离心，获得较纯的沉淀。 反复多次采用高速、低速离心操作，即可获得较纯的组分。 （二）密度梯度离心 （density gradient centrifugation）是样品在密度梯度介质中进行离心，适于分离密度相近而大小不同的物质。 三、影响因素 离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度 （一）离心速度 低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如5000r/min等。 高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如60000×g等。 相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。即： （二）离心时间 依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时间； 密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间，即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。 （三）温度 为防止欲分离物质在离心过程中的聚集、变形和失活，离心温度一般控制在4 ℃左右。 离心速度较低或者物质的耐热性较好，也可以在室温条件下进行。 超速离心和高速离心，转子高速旋转会发热而引起温度升高，必须采用冷冻系统。 （四）pH 离心介质的pH必须是处于待分离物质稳定的pH范围内，必要时可用缓冲溶液。 pH过高或过低都可能引起生物活性物质的变形、失活，还可能引起转子和离心机其它部件的腐蚀，应加以注意。 四、离心技术的应用 生物大分子的分离、浓缩和纯化 第二节 沉淀分离 通过改变溶液的条件或添加某种物质，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，与其它成分分离的技术。 是纯化生物大分子物质常用的经典方法 包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法和非离子聚合物沉淀法等。 一、盐析法 在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析”。 优点：①成本低，不需要昂贵的设备；②操作简便，安全；③对许多生物活性物质具有稳定作用；④对pH、温度要求不严格。 缺点：分离效果有限 （一）盐析的基本原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决定的。 当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。　　 （二） 盐类和浓度的选择 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等 硫酸铵最为常用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分离；蛋白沉淀物在2 mol/L~3 mol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保存一年；价廉易得；分离效果比其它盐好。 但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。 高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。 （三） 影响盐析的因素 1. 蛋白质的浓度 过高过低都不好，一般认为2.5 %