第二单元 免疫学实验教案.doc

[键入公司名称] 免疫学实验教案 研究生教育实习 潘熙萍( 2011/1/14 [在此处键入文档的摘要。摘要通常是对文档内容的简短总结。在此处键入文档的摘要。摘要通常是对文档内容的简短总结。] 实验一 免疫血清的制备 一、实验目的 熟悉免疫血清的制备过程； 了解动物实验的基本知识。 二、实验原理 将抗原物质经适当途径，按照预先制定的免疫方案免疫动物，经过一定时间，可刺激机体产生特异抗体并释放入血液，当血中抗体达到一定效价时采血，分离血清，即为特异性免疫血清（又称为抗血清）。因抗原具有多种表位，可激活多个克隆的B细胞活化产生抗体，因此，这种免疫血清又称为多克隆抗体。 本实验以绵羊红细胞（SRBC）作为免疫原，以家兔为免疫动物，制备兔抗养红细胞免疫血清（也称为溶血素） 三、器材和材料 1.动物 健康成年家兔，雄性，体重2-3kg；健康成年绵羊。 2.试剂 生理盐水、碘酒、75%酒精。 3.器材 剪刀、镊子、无菌注射器、量筒、无菌毛细滴管、无菌试管、离心管、三角烧瓶（200ml）、动物固定架、手术器械一套、塑料放血管等。 实验步骤 1.抗原制备 （1）用碘酒和75% 消毒绵羊皮肤，抽取颈静脉血液，注入含有等量阿氏液的三角烧瓶内，混匀。阿氏液既有抗凝作用，又适于储存SRBC4℃冰箱内，可使用3周。 （2）无菌取上述绵羊血于离心管中，用无菌生理盐水洗涤红细胞，2000r/min，离心5min，吸弃上清液和白细胞层，再用无菌生理盐水与SRBC混匀， 2000r/min，离心5min，重复3次。最后一次离心10min，以使血细胞沉积于管底，弃去上清液。 （3）根据红细胞积压，用生理盐水配成20%SRBC悬液。 2.免疫动物 （1）全班分为4组，每组选择健康雄性兔1只，用于免疫。 （2）用全血和SRBC悬液按下述方案免疫兔子。 （3）试血 末次注射后第7天，耳静脉采血1ml ,分离血清，用试管凝集试验滴定效价。（1：2000以上可用） 3、分离血清 （1） 颈动脉放血（心脏采血）并收集于无菌三角烧瓶中凝固后4℃冰箱过夜，分离上层血清。然后2500r/min离心10min，收集收集上层血清。 （2-20℃冻存。 五、实验结果 收获的血清应无菌，且无溶血现象。兔抗SRBC免疫血清的溶血效价应高于1：2000；兔抗人IgG免疫血清的效价应高于1：16。 注意事项 抗原制备、免疫动物及采集血清等过程应注意菌操作； 免疫的途径、次数、间隔时间因抗原性状不同而异，应合理设计免疫方案，并更具具体情况加以调整； 再次注射免疫原时，要防治过敏反应发生。 实验二 免疫细胞的形态观察 一、实验目的 掌握微量采血及血涂片的制作方法； 学习使用光学显微镜观察免疫细胞 二、实验原理 血涂片是临床化验中最常规的技术，也是血液学研究中的最基本技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏（Wright）染液染色后，不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将免疫细胞进行分类计数。 三、器材和材料 器材：医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片等 Wright）染液，瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。贮褐色瓶中备用。（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。） 1．采血 动物采血时先将耳部剪毛，酒精消毒后，刺破动物耳部皮肤，挤去第一滴血不要。 2．涂片 挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光30~40O为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（如图），推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀。 3．染色 待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴瑞氏染液盖满1~3min。然后滴加等量的缓冲液（pH6.4）或蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。 4．封片 　　经染色的涂片完全干燥后，用中性树胶封片保存。 5．观察 　　分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片，分辨不同的血细胞类型。 五、实验结果 画出血细胞的形态，标出并分析比较各种免疫细胞类型和形态特征。 实验三 大鼠外周血单个核细胞的分离 一、实验目的 掌握鼠外周血单个核细胞的分离的原理及操作方法。 二、实验原理 血液中各有形成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液