- 1、本文档共11页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
MTT实验
原理;
步骤;
注意事项;
一、原理
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法:通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配,过滤后4ordm;C避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。药物MTT法实验步骤(1)贴壁细胞:1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。104个/孔。同时,细胞贴壁后不可培养过久,以防过于密集。大多数肿瘤细胞最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大。
105个/孔。同时,为了观察药物对这类细胞的效果,可以较上一种细胞培养更长时间。
在做肿瘤细胞的时候,往往要根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.
00ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持h以上,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,在48h换液。 避免血清干扰高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大在加MTT前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的加DMSO前要把液体吸掉但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉可以试着将96孔板倾斜30度角,然后用枪尖慢慢吸一、MTT是什么
MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二
您可能关注的文档
- 第06章 b2望诊3望舌.ppt
- 第三单元 LapFinger腔镜手指.ppt
- 浅析古树移植技术.pdf
- 护理药学 第20节 利尿药.ppt
- 胸外科诊疗进展(副本).ppt
- 全科医师急诊案例要领.ppt
- 同济医院讲义汇编 2011.11.杭州摘要.ppt
- 热爱生命-关注健康--李伟教学大全.ppt
- 通排补养课件.ppt
- 急危重患者手术护理.ppt
- 2024年证券分析与咨询服务项目投资申请报告代可行性研究报告.docx
- 2024年铬酸酐项目资金申请报告代可行性研究报告.docx
- 2024年清洁胶项目资金申请报告代可行性研究报告.docx
- 2024年肉松饼项目投资申请报告代可行性研究报告.docx
- 2024年陆上泵项目资金需求报告代可行性研究报告.docx
- 2024年未硫化复合橡胶及其制品项目资金需求报告代可行性研究报告.docx
- 2024年精密温控节能设备项目资金筹措计划书代可行性研究报告.docx
- 2024年汽车覆盖件模具项目资金筹措计划书代可行性研究报告.docx
- 宋词行书钢笔字帖.pdf
- 我的暑假生活作文三年级300字10篇.pdf
最近下载
- 刍议核心素养理念下小学道德与法治情境教学研究-来源:中国校外教育(第2020022期)-中国儿童中心.pdf VIP
- 屋顶分布式光伏发电项目可行性研究报告2.doc
- QC诊断师培训分享试题.docx
- 结题鉴定表.doc
- 北师大版七上《去括号》说课稿2.pdf
- 对被执行人的拘留申请书.docx VIP
- 黑龙江省齐齐哈尔市铁峰区2023-2024学年九年级上学期期中考试英语试题.pdf VIP
- 肾脏疾病生活质量简表(KidneyDiseaseQualityofLifeshortForm1.3,KDQOL-SFTM1.3).pdf
- 《税法》说课课件.pptx VIP
- ASTM C231_C231M-24 Standard Test Method for Air Content of Freshly Mixed Concrete by the Pressure Method 用压力法测定新拌混凝土中空气含量的标准试验方法.pdf
文档评论(0)