hoechst PI染色.doc

2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。电子天平准确称取1mg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶于10ml PBS（PH 7.2），成100ug/ml的储备液，用前等量混合（注意避光） protocol: 1、收集细胞，数量需1－2×10E6个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析），离心，11,000rpm，5min。 2、 用1ml 冰冷的PBS重悬后，离心：11,000rpm，5min。 3、用200μl冰冷的PBS重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有4ml冰冷的70％乙醇的10ml离心管中，边加边摇匀。－20℃，过夜。（或者置4℃，1h后进行下一步） 4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml冰冷的PBS重悬，1,500rpm，5min。小心弃上清。 5、 加入含有40μg/ml 的PI，100μg/ml的RNase的PBS溶液500μl，37℃，培养30min－1h。 混匀。 溶液配方：PBS 910μl PI 80μl RNase 10μl 共1ml 6、过滤，供流式检测。 Hoechst 33342/PI双染色法 紫外光激发, Hoechst-PI双染在荧光显微镜下可见4 种细胞形态: 活细胞(VN) ,染成蓝色,核呈正常结构; 早期凋亡细胞(VA) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状; 晚期凋亡细胞(NVA) ,也被染成红色,但可见明显的染色质凝集。 非凋亡的死亡细胞(NVN) ,染成红色,核呈正常结构; 贴壁细胞： 1、培养细胞中加入hoechst染液，终浓度5μg/ml； 2、37℃，避光染色10min， 3、继续加入的PI染液，终浓度15μg/ml， 4、4℃，避光反应10min， 5、荧光显微镜下观察，照相。 悬浮细胞： 1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.2 5％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ ml，37℃孵育7～10min。 2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。 3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。 4．400目的筛网过滤1次。 5．流式细胞仪分析。 另外这是活细胞染色，还有固定后染色的：细胞处理完毕用甲醇：冰醋酸（3：1）在4度固定5min后，PBS漂洗，进行以上操作。 先染色后固定： Hoechst33258染色法 1．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。 2．细胞固定液4℃固定5min。 3．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。 4．蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。 5．封片剂封片后荧光显微镜观察。 Hoechst33342染色法 1．将Hoechst33342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml 37℃孵育30min。 2．4％的多聚甲醛和培养液以1：3混合，使多聚甲醛的浓度为1％，固定细胞5～10min。 3．固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。 4．荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为400～500nm。 以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色： 1．收集（0.5～3.0）×106个细胞，500～1000r/min，离心5min去上清。 2．PBS洗1次，500～1000r/min，离心5min去PBS。 3．用3％多聚甲醛50μl重悬细胞，室温下固定10min。 4．PBS洗1次，500～1000r/min离心5min去PBS。 5．用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞，终浓度为16μg/ml，孵育15min。 6．取10μl放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数500个细胞