PCR 方案.doc

讲述内容：??? 1、核酸电泳??? 2、杂交技术??? 3、PCR技术??? 4、基因芯片 一、核 酸 电 泳? （一）DNA的凝胶电泳凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。??? 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段;?????????? 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 ??? 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段;?????????? 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA ??????? 用于核苷酸多态性的分析 琼脂糖凝胶电泳的基本过程材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。 基本过程：制胶→放入电泳槽中并加入电泳缓冲液→取出梳子→将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中→一定电压条件下电泳→合适的时间后停止电泳→取出凝胶进行溴化乙锭染色→凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果 注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围??? 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： 1 DNA分子的大小2 构象3 凝胶浓度4 电压5 缓冲液 特殊的凝胶电泳倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分离分子量10～2000kb的DNA分子； 钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可分离大于107bp的DNA分子 （二）RNA 电 泳?? 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 二 核酸杂交技术（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 Southern Blot 操作步骤：DNA?→琼脂糖电泳→印迹转移→预杂交→杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或显色 （二）Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 操作过程mRNA提取→甲醛变性电泳→印迹转移→预杂交???? 杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或化学发光 （三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：???????????????????????????? 非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 2、标记方法 （1）切口平移法 （2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法 三 PCR技术PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖； （二）基本要素1 Taq DNA聚合酶：?? 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶??????????? ①5’→3’DNA聚合酶活性；??????????? ②无3’→5’外切酶活性，???????????????? 35轮0.25%错配，与原始模板有差别； ? 最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸? 半衰期：92.5℃ 130min ????????????????? 95℃?? 40min?????? ????????????????? 97.5℃? 5—6min? 变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性 pfu DNA 聚合酶 耐热5’→3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精确度：pfu Taq?? 但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文