ZL-JB-194-2014 细菌内毒素检查操作规程.doc

有限公司GMP管理文件 文件名称 细菌内毒素检查操作规程 ZL-JB-194-2014 共10页 制订日期 年 月 日 审核日期 年 月 日 批准日期 年 月 日 质量部 颁发日期 年 月 日 质量部、车间 生效日期 年 月 日 办公室、质量部、生产部、车间 目的：建立一个测定细菌内毒素的检查方法。 适用范围：适用于需测定细菌内毒素的药品等。 责任者：质量部检验员对实施本规程负责。 规程 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中的细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方式，即凝胶法和 原理： 1.1细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中的细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2细菌内毒素检查包括两种方式，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。 1.3细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 1.4细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.5细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.6凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定法的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。 1.7试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在 250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 细菌内毒素检查法(凝胶限量法) 2.1细菌内毒素检查法（凝胶法）实验程序如下： 2.1.1实验准备：试剂、仪器、及用具等 2.1.2确定药品的细菌内毒素限值（L） 2.1.3计算供试品的最大有效稀释倍数（MVD）或最低有效浓度（MVC） 2.1.4鲎试剂灵敏度复核 2.1.5药品与鲎试剂相容性的初筛试验 2.1.6供试品干扰试验以及干扰试验的验证 2.1.7供试品日常的内毒素限量检查。 实验准备 3.1 仪器、设备： 37±1℃恒温水浴或适宜的恒温器具。 3.2器具：凡与供试品或试剂直接接触的器具必须经除热原处理（250℃干烤30min以上）;塑料用具须确证不干扰实验结果。 3.3试剂： 内毒素工作标准品、鲎试剂、鲎试验用水、PH调节剂。 4、确定药品的细菌内毒素限值（L） 4.1药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L = K/M 式中：L—供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K—按照规定的给药途径,人体每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量,以EU/(kg.h)表示; M—人体每公斤体重每小时最大用药剂量,以ml／(kg.h)、mg／(kg.h)或U／(kg.h)表示，中国人均体重按60公斤计算，人体表面积按1.62m2计算。按注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M)。 5、鲎试剂灵敏度复核 5.1鲎试剂灵敏度定义：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。 5.2目的 5.2.1考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确， 5.2.2考察试验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。 5.3鲎试剂灵敏度复核的条件 5.3.1使用新批号的鲎试剂， 5.3.2试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时。 5.4溶液配制 编号 内毒素浓度/配制内毒素的溶液　 稀释用液 稀释倍数 所含内毒素的浓度 平行管数 A 2 λ/检查用水 检查用水 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 4　 4 4 4 B 无／检查用水 ----- ----- ----- 2 内毒素浓度(EU／ml) 2λ λ 0.5λ 0.25λ NC 0.1ml鲎试剂 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 反应条件 37±1℃，60min±2min 编号 内毒素浓度/配制内毒素的溶液　 稀释用液 稀释 倍数 所含内毒素 的浓度 平行 管数 A 无/检查用水 ----- ----- ----- 2 B 2λ/检