东北师范大学生物化学聚丙烯酰胺凝胶圆盘状电泳法分离血清蛋白2.doc

实验 聚丙烯酰胺凝胶圆盘状电泳法分离血清蛋白 Poly-acrylamide Gel electrophoresis(PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，透明且有弹性，化学性质比较稳定，受PH和温度的变化影响较小，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，几乎不产生吸附和电渗作用。在制备凝胶时通过改变单体浓度和交联度，可以根据实验目的及样品分子特性,随意控制凝胶孔径大小，且制备的凝胶重复性好。聚丙烯酰胺凝胶电泳(Poly-acrylamide Gel electrophoresis, 简称PAGE)常用于蛋白质的分离鉴定，也可用于分离小分子核酸或核酸片段。此外，由于聚丙烯酰胺凝胶纯度高及不溶性，不致污染样品，该法还适用于少量样品的制备。本实验通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和操作技术。 一、[实验原理] 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide ,简称Arc）和交联剂甲叉双丙烯酰胺(N,N＇-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化系统的作用下,聚合而成的具有三维网状立体结构的大分子物质。本实验以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂，过硫酸胺(AP)为引发剂。 O —CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2— CH2=CH—C C=O CONH2 NH NH CH2=CH—CONH2 + CH2 CH2 NH NH CH2=CH—C C=O CONH2 O —CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2— 丙烯酰胺 N,N’-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 一般情况下，凝胶的浓度大或交联度大，蛋白质迁移的速度慢，电泳时间长，反之迁移速度快，电泳时间短。通常凝胶的筛孔透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的，而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。 聚丙烯胺凝胶电泳所以能把一个蛋白质混合 物分离开来 , 除决定于被分离分子的大小和形状外 , 还决定于分子所带的电荷等因素 本实验采用电泳基质的不连续体系，这种不连续的PAGE在电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应；②凝胶的分子筛效应；③一般电泳分离的电荷效应。 下面就这三种物理效应的原理加以说明： 1.样品的浓缩效应 由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳时，受到浓缩效应的影响，区带变窄,然后再被分离。 （1）凝胶层的不连续性： 浓缩胶：为大孔凝胶，凝胶浓度2.5%,用光聚合法制备，有防对流作用。样品在其中浓缩。 分离胶：为小孔胶，凝胶浓度7%,一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离。也有防对流作用。 由于凝胶层的不连续性，蛋白质分子在大孔与小孔凝胶中受到的阻力不同,移动速度由快变慢,在界面处就会使样品浓缩，区带变窄。 （2）缓冲液离子成分和pH的不连续性 浓缩胶pH6.7；分离胶pH6.9；电极缓冲液PH8.3； 在浓缩胶与分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。在浓缩胶中，甘氨酸只有小部分成为负离子（pI为6.0）；蛋白质样品均以负离子形式存在，所以，它们的有效迁移率按下列次序排列：mclαcl＞mpr-αpr-＞mGlyαGly。从而起到进一步浓缩蛋白质的作用。 样品进入分离胶后，甘氨酸全部成为负离子，其泳动率超过蛋白质样品，蛋白质样品被留在后面，仅按分子筛效应和电荷效应进行分离。 （3）电位梯度的不连续性 在不连续系统中，自动形成电位梯度差异,电位梯度的高低将直接影响电泳速度的快慢。电泳开始后，由于快离子()的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。因为电导与电位梯度是成反比的：电位梯度（E）= 电流强度（I）/ 电导率（η）。所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质在快离子后面加速移动，追赶快离子。夹在快、慢离子()间的蛋白质样品就在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条狭窄的区带。 2.分子筛效应 分子量大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，待分离分子通过凝胶网孔的能力取决于凝胶孔的大小和形 状 , 也取决于被分离分子的形状及大小。不同蛋白质分子受凝胶阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率