吖啶橙溴化乙锭双荧光染色.doc

??吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色 AO / EB原理与流程 zhongyisheng: 1、原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。 2、AO/EB染色及观察结果：取 20-100μl的1：100稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置20min，PBS洗涤2-3遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数20-200个细胞。 ym1051: 1、能否提供具体实验步骤? 2、您在文中所说的1：100稀释的染色剂是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞? zhongyisheng: 1、用1mlEP管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂（如BSA）加入EP管吹打即可。 2、消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。 ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗? zhongyisheng: 的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。这是悬浮细胞的典型方法。当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。 医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享： 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）： （1）细胞爬片：在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。 （2）如制成细胞悬液：取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。 （有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。细胞离心，悬液于PBS中，取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液，轻轻吹打，滴至载玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。） fffwu: 请问:请评价AO/EB法观察细胞凋亡的方法! 哪里有相关图片! jmtang: 尤其第一篇文献！? 1.Critical evaluation of techniques to detect and measure cell death – study in a model of UV radiation of the leukaemic cell line HL60 Marina Leite A1, Margarida Quinta-Costa A1, Pedro Simas Leite A1, José Eduardo Guimar?es A1 A1 IPATIMUP, Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, Portugal Abstract: The reliability of eight distinct methods (Giemsa staining, trypan blue exclusion, acridine orange/ethidium bromide (AO/EB double staining for fluorescence microscopy and flow cytometry, propidium iodide (PI) staining, annexin V assay, TUNEL assay and DNA ladder) for detection and quantification of cell dea