常用细胞培养方法(简易版).doc

常规细胞培养方法 传代培养法5 Q% P5 C- l% W+ D# ?. x原理 6 W$ ^0 H; R) n) x! p A* T0 f ? 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时# {1 M% X v \- g; X5 t??X M也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。6 V4 A$ J B6 e; C* @材料和试剂8 s# [ n3 i7 }5 d, R; u1. 细胞：贴壁细胞株 4 Y, z8 k/ 2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） ) e1 C1 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等, M* `, k6 H3 { d操作步骤9 H! Q+ x1 g/ j5 c吸除培养瓶内旧培养液。5 ^9 V7 _: V1 x1 Y/ ^2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。% S! z x D( S3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。/ T7 h, ]3 i- R1 C4. 吸除消化液，向瓶内注入液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失。1 @) S, I) O; b% Q! C:5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。, B* w* P y9 h$6.把细胞悬液培养瓶中，置温箱中培养。: \/ @+ X5 b* O??G% d+ E无菌操作注意事项 4 ^: p; k) R1 \4 A/ c1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2 R1 z4 S2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 # ]+ B$ D- Q/ J3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 5 @* {6 4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 ) t/ C% l0 M, O8 W; C) ` u??[: s5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。 2 ^ f/6. 吸溶液的吸管等不能混用。细胞培养的一般过程准备工作; Y5 r R ~( l2 h+ m　　准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等。; v3 ???z! w6 H2 P2 b0 y. p/ v+ d取材9 f0 G, e5 T. ~; 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。. F??R% q8 M( 培养% ?5 y??B3 d6将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。( y h1 B$ F4 b1 f, F. a V5 z1 y正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH 是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2 浓度也要定时检查。. H4 h; u) m$ r8 R一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代