幽门螺杆菌L 型抑制胃癌细胞凋亡.doc

幽门螺杆菌L 型抑制胃癌细胞凋亡 的实验研究 【摘要】 背景与目的: 研究幽门螺杆菌L 型( Hp- L 型) 抑制胃癌细胞BGC- 823 凋亡的作用及其作用机制。材料与方法: 将BGC- 823 细胞与Hp- L 型以不同比例( 1 20、1 100、1 500) 共培养, 以不加Hp- L型为对照组, 在不同时段进行以下实验: 倒置显微镜观察细胞形态学变化; 透射电镜观察细胞凋亡及超微结构变化; 流式细胞仪检测细胞凋亡率;结果: 与对照组相比, Hp- L 型作用BGC- 823 细胞后, 倒置显微镜观察到BGC- 823 细胞增殖旺盛, 瘤巨细胞增多, 并出现明显的凋亡抑制现象; 电镜观察到BGC- 823 细胞凋亡形态特征及凋亡数目减少; 流式细胞仪检测结果显示Hp- L 型可降低BGC- 823 细胞的凋亡率( P 0. 05) ;结论: Hp- L 型可抑制胃癌细胞BGC- 823 凋亡 【关键词】幽门螺杆菌L 型; 胃癌细胞BGC- 823; 凋亡; 幽门螺杆菌( helicobacter pylori , Hp) 是引起人类慢性胃炎、胃溃疡、胃癌等病变公认的致病因子, 且与胃癌的发生直接相关, 被WHO 定为I类致癌物。随着人们对Hp 研究的深入, 发现Hp 在不利于其生长繁殖的条件下, 如营养缺乏、有氧胁迫、延期培养、亚致死剂量抗生素、pH 值改变等因素作用的环境中, 均可见到Hp 发生细胞壁缺陷, 形成球形变异的Hp, 即Hp_L 型[1 ]。目前国内外有关Hp 感染与胃癌关系的报道较多, 而Hp_L 型 感染在胃癌凋亡中的作用研究较少。本实验中, 我们将 胃癌BGC_823 细胞与Hp_L 型以不同比例共培养, 在不 同时间点观察Hp_L 型作用后胃癌细胞的形态学改变、 超微结构改变, 同时进行细胞凋亡率和关键基因表达等 指标的检测, 以了解Hp_L 型对胃癌细胞凋亡的影响并 探讨其作用机制。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 细胞株人胃腺癌上皮细胞株( BGC_823) , 购自中国科学院上海细胞生物学研究所。 1. 1. 2 幽门螺杆菌幽门螺杆菌国际标准菌株 1. 1. 3 主要试剂RPMI 1640 培养基; 碘化丙啶( propidium iodide, PI) 和胰蛋白酶。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 Hp 的培养及Hp_L 型的诱导将Hp 接种于哥伦比亚血琼脂平板上( 含10 mg/ L 万古霉素、2 500 U/ L 多黏菌素、2 mg/ L 的两性霉素B 和5 mg/ LTMP) 37 ℃微需氧( 85% N2, 10% CO2, 5% O2) 饱和湿度下培养。每日涂片行革兰染色, 油镜下观察Hp 形态, 培养2~ 3 d 时, Hp 生长良好, 呈杆状、螺旋形、“ S”形或海鸥形, 革兰染色为阴性( 红色) ; 培养4~ 5 d 后Hp 呈球 形, 革兰染色大部分呈阴性( 红色) , 少数呈阳性( 紫红色) , 即完全转变为L 型。 1. 2. 2 细胞培养将BGC_823 细胞置于含10%NBS 的RPMI 1640 培养液中, 在37 ℃ 、5% CO2 培养箱中常规培养及传代。 1. 2. 3 倒置显微镜观察BGC_823 细胞常规培养传代, 收集细胞制成单细胞悬液, 以每孔1% 105 个接种于6 孔板中, 待细胞贴壁后, 以1 20、1 100、1 500的比例加入Hp_L 型, 细菌计数为分光光度计测定细菌悬液的浓度乘以加入细菌悬液的体积, 以不加Hp_L 型为对照组, 然后加培养液至每孔3 ml, 分别培养24 h 和48 h, 并在这2 个时间点用倒置显微镜直接观察。 1. 2. 4 电镜形态学观察收集不同比例的Hp_L型作用24 h 后的BGC_823 细胞及对照组细胞,3 000 r/ min 离心10 min, 弃上清, PBS 洗涤1 遍, 4℃ 预冷的2. 5% 戊二醛固定, PBS 洗涤, 1%锇酸固定, 系列丙酮脱水包埋, 制备超薄切片, 醋酸、双氧铀及铅染液染色, 透射电镜观察。 1. 2. 5 流式细胞仪测定细胞凋亡率将BGC_823细胞按每孔2. 5 % 104个接种于6 孔板中, 细胞贴壁后,按上述比例加入Hp_L 型, 分别培养24 h、48 h 收获细胞, PBS 洗涤, 300 目尼龙网过滤, 10 ml PBS,1 000 r/ min 离心5 min, 洗3 次, 弃上清。70%冷乙醇固定4 h, 然后1 000 r/ min 离心5 min 去除固定液, PBS 洗涤2 次, 加入100μl RNase( 100 μg/ ml) , 37 ℃ 水浴 30 min。再加入100 μl PI 染液(