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实验一 发光细菌的急性毒性评价试验 实验器材 菌株 培养基 酵母膏 0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油 0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。 溶液、试剂及待测物质 酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4 （AR），甘油（AR）二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。 4.仪器及其他用品 发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下： FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+H2O+RCOOH+光 具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为407-409 nm处的蓝绿光。 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降， ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。 操作步骤 1. 待测样品处理 1) 萃取 将降解后的培养液组(样品，30 mL)用等体积的乙酸乙酯萃取四次，前两次不酸化，后两次需用HCl酸化（浓盐酸，一滴，约0.2 mL）。步骤如下：先加一滴浓盐酸（如需酸化），再加入30 mL乙酸乙酯，将锥形瓶用封口膜及报纸封口，放入摇床摇30分钟，取出，将上清液与下层液体分离，继续进行下一次，上清液即我们所需样品。 2）氮吹 四次萃取液合并后，摇匀，并取10 mL的萃取液于试管内在40℃下氮吹至乙酸乙酯挥发干净，并放入-20℃冰箱待用。2.培养基的配置以及发光细菌的培养 配置培养基所需试剂及剂量如下表所示： 培养基成分 培养基含量（g/L） 酵母粉 5 蛋白胨 5 NaCl 30 Na2HPO4 5 KH2PO4 1 甘油 3 培养基为100 mL，按上表加入各成分后，需将pH调整至7.2，发光细菌的接种量为10%，培养温度为18℃，需放置在150 rpm的暗摇床中，培养18-20个小时后达到发光细菌的稳定生长期，即可以进行毒性评价使用。 接种：接种前，配置好的培养基应放入灭菌锅内灭菌，灭菌结束后，取出放入无菌操作台内冷却至室温，同时无菌操作台用紫外灯消毒15分钟，消毒完成后打开通风，点燃酒精灯（一切操作要在酒精灯边完成），将培养基封口膜打开约三分之二，然后将原本保存在冰箱内的装在EP管内的发光细菌用移液枪移入培养基内，即可，随后放入暗摇床内培养。3.利用发光细菌进行毒性评价 在冷藏的样品中加入2.5 mL配置好的2%DMSO和98%的3%NaCl混合溶液进行溶解，由于样品是放在-20℃的冰箱内保存，氮吹后的样品较难以溶解，故可以在60℃的水浴锅内进行水浴10分钟。 用配置好的DMSO和NaCl混合溶液(98%的3%NaCl和2%的DMSO)调节发光细菌溶液浓度，使其（空白样）发光度在800-1200范围内，然后即可测定样品的发光度：在溶解了的2.5 mL样品中取0.2 mL于小试管中，并加入1.8 mL的DMSO和NaCl混合溶液，再加入200 μL可供检测的菌液，摇匀，静置5 min后测定并记录结果。每个样品做3组平行样，得出的结果取平均值，作图，得到结果。4.数据处理与分析方法 相对发光率(%)=样品发光强度*100%/对照发光强度 溶液、试剂及待测物质 5mol/L HCl溶液； 卡然诺氏溶液：无水乙醇（或95%乙醇）：冰醋酸 3:1，需现配现用； Shiff试剂：0.5g碱性品红加100ml蒸馏水于三角烧瓶中煮沸5min，并不断搅拌使之溶解。冷却到58℃时，过滤于棕色试剂瓶中，待滤液冷却至25℃时再加入10ml 1mol/L HCl和1g Na2S2O5（或K2S2O5）充分振荡使其溶解。塞紧瓶塞用黑纸包好，置暗处24h后，检查染色液，若透明无色即可使用。可将其置于4℃冰箱保存，若出现沉淀则不能继续使用； SO2洗涤液：