间接ELISA检测抗体操作步骤.PPT

ELISA检测原理及方法 杭州赫贝，专业实验外包服务 联系人：李海实验目的 实验原理 常用ELISA方法 实验材料 操作步骤 实验目的 酶联免疫吸附测定（ 简称ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,通过抗原（抗体）吸附在固相载体上，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。 实验原理 （1）抗原或抗体吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体通过共价键与酶连接形成酶结合物，并且此种酶结合物仍能保持其 免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，并且颜色反应的深浅与待检样品中相应抗原或抗体的量成正比。 常用ELISA方法 实验材料 1.包被缓冲液（PH9.6 0.05M 碳酸盐缓冲液）： NaCO3 1.59g NaHCO3 2.93g 加去离子水1L。 2.洗涤缓冲液（PH7.4 0.15M PBS）: KH2PO4 0.2g NaHPO4.12H2O 2.9g NaCl 8.0g KCl 0.2g Tween-20 0.05% 0.5ml 加去离子水1L。 3.稀释液（1%BSA）： BSA 1g 加PBS100ml。 4.封闭液： 5%蔗糖和2%BSA或5%脱脂乳。 5. 96孔酶标板。 6.酶标仪。 7.显色液和终止液。 1. 包被抗原：将定量好的抗原用包被液稀释到适当浓度，一般为1～10ul/孔，每孔加200ul，37℃ 温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。 2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加300ul洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒 置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3. 封闭：加5%蔗糖和2%BSA的封闭液200ul，37℃放置1小时。 4. 洗涤同2。 5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作倍比稀释，在每个稀释梯度取100ul样品加入包被好抗原的酶标板空中，同时作空白对照和阴性对照，37℃放置2h。 6. 洗涤同2。 7. 加对应的辣根过氧化物酶标记的抗体, 每孔100ul, 放置37℃ 1小时。 8. 洗涤同2。 9. 显色：显色液100ul，室温暗处10－－15分钟。 10. 加终止液：每孔50微升。 11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数。 间接ELISA检测抗体操作步骤