全面的液相色谱知识介绍.pdf

全面的液相色谱知识介绍 一、色谱柱技术简介 高效液相色谱法（HPLC ）是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气 相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等 手段发展而成的分离分析方法。与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处 理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性的，流出组分 可回收等优点。 图1 色谱分离原理示意图 HPLC分类： 图2 HPLC分类 反相色谱是流动相极性大于固定相极性的情况，在现代液相色谱中应用最广 泛，现代液相色谱分析工作的70%以上是在非极性键合固定相上进行的。亲水相 互作用色谱长期被人们使用，但是Hilic 这个名词仅仅是最近才被使用，分析物 通常是极性化合物，我们课题组检测三聚氰胺即采用的是Hilic 方法，因为三聚 氰胺是极性很强的化合物在反相色谱上基本没有保留。亲水作用色谱技术可以被 看作正相色谱向水性流动相领域的延续。流动相是水相缓冲液(40%)及有机溶剂。 固定相是强亲水性的极性吸附剂，如硅胶键合相，极性聚合物填料或离子交换吸 附剂。这些固定相的共同特点是它们和水的作用力很强，因此属于“亲水性”。 Hilic 模式使用的梯度和反相模式相反。初始条件包括高比例有机相，典型的浓 度是 95%有机相如乙腈，逐步降低到水相。因此，Hilic 色谱又被称为反反相色 谱。 色谱柱作为分离的场所和工具，其性能的优劣，从根本上决定了分离效果的 好坏。 色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制成，柱长10～30cm ，内径2～ 6mm ，以4.6mm的内径最常用。根据键合基团极性不同，化学键合相可分为非极 性、中等极性和极性三类。常用色谱柱有：ODS柱（C18柱）、氰基柱、氨基柱 等。 色谱柱固定相材料通常由载体基质和修饰基团两部分组成。根据载体基质材 料，常用HPLC分离填料分类：  无机基质:硅胶、氧化锆、氧化铝、二氧化钛等；  交联聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、多糖凝胶等；  复合材料:无机基体复合一层聚合物。 图3 色谱柱硅胶小球 图4 硅胶结构示意图 C18色谱柱，是将十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基经多步反应而成。 Hilic色谱柱固定相的主要特征：固定相表面是与水有很好的亲和性的强极性 基团，如氨基、羟基、酰胺基等。早期的亲水作用色谱分离材料主要是原有的正 相色谱固定相，如硅胶、氨基键合硅胶、二醇基键合硅胶等。近年来，专门用于 亲水作用色谱的分离材料也已出现，其主要是将含酰胺基、羟基、两性离子等强 极性基团的分子键合到硅胶上作为Hilic分离材料。 值得引起注意、借鉴和学习的知识： 1. 拿到一根从未用过的色谱柱是一定要先看其使用说明；根据说明说测试新色 谱柱的柱效，保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件；定期检测柱效， 定期检测仪器的谱带展宽； 2. 样品方面：除去微粒及杂质，了解样品在流动相中的溶解度，如样品的溶剂 不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出，了解样品 与色谱柱的基质/填料是否相互作用； 3. 流动相方面：除去微粒，使用超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低， 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内，缓冲液（盐）的浓度不宜过大，要注 意考虑流动相对样品的溶解度；pH范围2~11.5 。使用有机缓冲液，浓度以 10~50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液。分离碱性物质， 所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。 4. 在线保护装置：给色谱柱提供物理的保护，除去样品及流动相中的颗粒；给 色谱柱提供化学的保护，防止分析柱被化学污染；装置方面：在线过滤器、 自装填料保护柱、预装保护柱； 在线过滤器： （我们项目组正在使用） 作用：防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效，在需要高柱效的分析时中常用 保护住：可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在 用微柱时。建议我们项目组也可以采用保护柱。 在线过滤器的清洗：将在线过滤器拆下，浸入20~30%硝酸溶液中，超声15 分钟，取出用水洗净即可，如果使用的是正相系统