PCR及其衍生技术.ppt

第十一章 聚合酶链反应 PCR及其衍生技术;;1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。 1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。 70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。;1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。” 核酸体外扩增最早设想被遗忘原因: （1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物； （2）1970年Smith等发现了II型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。;1976年，台湾省籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人?-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。;1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。 1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。;;;高温变性;低温退火;中温延伸;PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。 此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。;理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。 由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。 以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。;PCR扩增曲线;;一、PCR 的反应体系;1、引物;基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。;①引物长度： 15-30bp，常用20bp左右 — 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适 延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的??适温度 （74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性 ②引物扩增跨度：以500bp为宜 — 特定条件下可扩增长至10kb的片段 ;③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 — G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 — ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3 个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区 引发错误延伸 ④避免引物内部出现二级结构和引物间互补 —特别避免 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 ;⑤引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰） — 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败 ⑥引物5′端可修饰 — 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特 异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA 互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱 基而对PCR反应无影响 ;3’;⑦引物的特异性： — 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 ⑧引物量： — 每条引物的浓度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好 —引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会;实例：设计人类GAPDH基因mRNA的引物;我们设计的引物，是根据GAPDH的mRNA序列设计的，理论扩增长度是318bp，但它却在人类基因组上扩增出了两个片段； 第一个片段来自12号染色体的扩增，长度为2409bp；第二个片段来自X染色体的扩增，片段长度是318bp。 那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类GAPDH基因片段呢？;12号染色体扩增出的序列是真正的GAPDH基因。 在下面的序列比对中，我们可以发现，X染色体上被扩增出的序列实际上是GAPDH的加工的假基因（processed pseudogene）。 因此，如果我们能保证作为模板的cDNA不混杂有染色体DNA，就可以用这一对引物扩增GAPDH。;2、酶及其浓度;Taq 酶的保真性不高 5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切