2、分子克隆工具酶和其应用.ppt

基因工程工具酶及应用 工具酶种类 限制性内切酶—用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化修饰 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类—用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 限制性内切核酸酶Restrict endonuclease 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c 3 4 a b c 4 a b c a b c ExoIII用于顺序缺失 ExoIII ExoIII [α-32P] [α-32P] dCTP dCTP 5P P5 5P P5 3HO OH3 3HO OH3 ExoIII 用于 DNA 标记 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。 -- RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂(100℃加热15min仍具活性), 用于除去DNA样品中的RNA分子 -- 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA RNase 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。 RNase H 特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值, 当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口 DNase I Mn++存在时 Mg++存在时 DNase I 作用特点 DNaseI HO P 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ DNase I与 Pol I 的 切口移位 Pol I DNA 聚 合 酶 DNA polymerase E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol I 参与DNA修复, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 pol II 同上 具3’→5’外切酶活性 pol III 参与DNA复制, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 E.coli DNA聚合酶I (pol I) E.coli pol I的特点 -- 具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, pol IK) -- 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 -- 外切酶活性 用途 -- 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） -- 补齐5’-突起端 -- 合成第二条cDNA -- 切口移位制备探针 特点： 5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA, 其切除速度分别为40和 4000nt/min 用途： 制备高比活性探针(1010 cpm/μg DNA); DNA末端修饰---缺失 T4 DNA聚合酶 外切酶活性 聚合酶活性 无dNTP dNTP · AMV(Avian myeloblastosis virus)反转录酶 --结构与酶活性 反转录酶以α，αβ，ββ形式存在，其中β(无活性)→P32(内切酶活性)+α→聚合酶 + P24(RNase H活性)，各步反应由蛋白