第04讲单克隆抗体.ppt

第一节 杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 第一节 杂交瘤技术的基本原理 第三节 基因工程抗体制备 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。 第四节 单克隆抗体的应用 从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； 应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段； 构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体； 表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。 构建噬菌体抗体库 模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性 （二）噬菌体抗体库技术的特点 避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 可获得高亲和力的人源化抗体 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体 检验医学诊断试剂 蛋白质的提纯 小分子抗体的应用 抗体融合蛋白的应用 双特异抗体的应用 抗体库技术的应用和前景 配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮? “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏 杂交瘤细胞的冻存与复苏 防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡 细胞冷冻的意义 第二节 单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。 一、单克隆抗体的产生 动物体内诱生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只 体外培养法： 中空纤维培养系统? 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除 腹腔注射法 前5天进行,预先腹腔注射pristane （1～5）×106细胞 1～3w形成腹水 高滴度腹水 可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞） 二、 单克隆抗体的纯化 ELISA ELISA 多头加样枪 。 免疫荧光法 盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析 McAb的纯化 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot 三、 单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性 （一）单克隆抗体的特性 优点 ： 在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 （二）单克隆抗体的优点与局限性 局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高 McAb PcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高 得量 高 低 特异性 高 低 　　 稳定 　　低 高 沉淀反应 无 有 成本 高 低 M