四 细胞融合与单克隆抗体.ppt

三.细胞融合的原理 膜结构：脂质双分子层，流动镶嵌模型 细胞膜的流动性：环境因素等诱导因素使细胞膜的脂类分子的有序排列改变。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.在促融剂的作用下，两原生质体或细胞相互靠近呈致密状态。 2. 相互凝聚的细胞，在融合制剂的作用下，细胞膜性质发生变化，细胞膜发生粘连，形成细胞桥，两膜之间形成微孔。 3.胞质渗透----两个粘连细胞的胞质通过细胞桥进行细胞质相互渗透融合。 4.细胞核融合----胞质融合后，继而发生核的融合形成一个新的单核杂种细胞，不能形成单核的融合细胞逐渐死亡。 一、细胞融合形式 1、两种完整细胞的融合 2、核体与完整细胞或胞质体的融合 3、微细胞与完整细胞的融合 4、生物大分子引入完整细胞 二、人工诱导的融合方法 在体外培养的细胞发生自发融合的频率是很小的（10-4~10-6之间），因此，必须要采用一定的方法来促使细胞融合，主要方法有生物、化学和物理法。 1、灭活病毒诱导的细胞融合----生物性 2、聚乙二醇介导的细胞融合----化学性 3、电诱导融合----物理性 原理 仙台病毒(HVJ)是由两层磷脂组成的外膜包裹着RNA和蛋白质的复合体，毒性小，易被紫外线灭活。 实验证明：仙台病毒HVJ的外膜是诱导细胞融合的活力部位，与其外膜上的磷脂成分有关，即使被超声波打碎的病毒碎片仍具有促进细胞融合的功能，而与其内部RNA活性无关，即可用灭活的HVJ发挥促融作用。 融合要点 细胞的融合与HVJ数量有密切关系，每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附着在细胞膜上，细胞才能凝聚。 细胞最适的凝聚温度是4℃，细胞融合的最适温度一般是37℃。因此，在HVJ促融过程中，要先在4℃下细胞凝聚，然后恢复在37℃融合。 缺点： 由于病毒的致病性与寄生性，制备比较困难；体外诱导产生的细胞融合率比较低，重复性不够高，所以近年来已不多用。 PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。 缺点： 1、设备比较昂贵 2、 参与融合的细胞体积大小不同 3、参与融合的细胞膜性质不同 难以形成标准化的操作程序。 几种融合方法选择 具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。 诱导动物细胞融合，仙台病毒诱导、PEG法、电融合法都适用； 植物细胞融合常用PEG法和电融合法； 微生物细胞融合只适用PEG法 。 影响动物细胞融合的因素 1、细胞种类和性质的影响： （1）细胞的表面性质： （２）细胞的种类和亲缘关系。 ２、融合温度、运动状态、pH 值、O2等环境条件的影响 3、离子强度及离子种类的影响 Ca2+ 50-100mmol/L 筛选：需要将异核体从同核以及未发生的融合的亲本细胞中分离出来。 ----非选择性筛选 ----非选择性筛选 一、非选择性筛选 1、利用抗药性筛选系统： 利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感 亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 如果在含有上述两种抗生素的培养基上培养，只有杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长。 2、营养互补筛选系统： 细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。 3、温度敏感突变型 杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉素。 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。 4、利用基因缺陷互补的筛选---常用HAT培养基的筛选系统 1）. 正常体内核苷酸的生物合成 两条途径 正常途径----糖、氨基酸——核苷酸——DNA 。氨基喋呤 （A）能阻止核苷酸的正常合成途径。 补救途径----启用HGPRT酶（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）催化H(次黄嘌呤) 合成GMP； TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶）催化T(胸腺嘧啶) 合成TMP， 来合成核苷酸。 原理 氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。 融合所用的瘤细胞一般是突变的缺陷型细胞（HPRT- 或TK-