第8篇DNA重组.ppt

重组DNA技术 DNA Recombination Technique;基因克隆的原理 核酸的提取和检测 核酸的分子杂交 PCR技术 基因文库的构建 基因表达;重组DNA技术的原理; 基因工程的操作过程;目的基因的克隆;核酸的提取及检测;基因组DNA的分离与纯化;一般步骤;cDNA的分离与纯化;（2）The first strand synthesis; （3）The second strand synthesis;;cDNA第二链的合成方法－置换合成法;cDNA第二链的合成方法－置换合成法;质粒DNA的分离与纯化;质粒DNA－碱裂解法原理;核酸的检测; 凝胶电泳技术;琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力;指示剂 溴酚蓝，二甲苯青 终止酶反应 便于加样 监视实验进行 染色剂 溴化乙锭EB 吖叮橙;操作过程;DNA分子大小的检测;对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带，更无法用Agarose电泳进行定量了。 能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。 ;核酸的分子杂交;分子杂交的特点和应用;Southern blot;Northern blot;菌落原位杂交;荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH);PCR技术 The polymerase chain reaction ;PCR原理; a-地中海贫血症是一种遗传性的血红蛋白合成紊乱的疾病，特点是成人血红蛋白的一条或多条球蛋白链减少或丢失。;分子标记技术; RFLP DNA RAPD 基因型 AFLP RNA 形态性状 Pro 生理生化指标 表现型 细胞学标记 其他性状;分子标记的种类;简单序列重复 SSR，Simple sequence repeat;;基因文库的构建;;基因组DNA文库，Genomic libraries : 含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体； cDNA文库，cDNA libraries：是指含有所有重组cDNA的克隆群体。 ;基因文库的构建流程;目的基因的获取;化学合成法获取目的基因;用于基因克隆的载体;载体的基本特点;质粒载体;噬菌体载体;粘粒载体，柯斯质粒（Cosmid）;人工染色体;YAC 酵母人工染色体;BAC 细菌人工染色体;名称;DNA的体外重组;EcoRⅠ;;DNA连接酶（DNA ligase）;;重组DNA分子的转化;阳性克隆的筛选和检测;阳性克隆的检测方法;(插入失活法) 抗药性标记选择; 蓝-白筛选（α互补）;乳糖操纵元;α互补的检测;基因文库的应用;基因组文库与cDNA文库;课堂讨论; 基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。;表达载体;; 重组DNA医药产品;Phage packaging mix;Manufacture foreign gene. Here one manufactures human insulin, purifies it, sells the product and becomes a multi-millionaire.;;本章内容总结;Functional genomics