苹果主栽品种高效遗传转化系统的建立.pdfVIP

遗传 学 报，25(2):160-165,1998 ActaGeneticaSinica 苹果主栽品种高效遗传转化系统的建立 及其影响因子的研究 张志宏 ‘方宏药“景士西 ‘王关林“吴禄平 ‘朱 祯， (1沈阳农业大学果树园艺系 沈阳 110161) (2辽宁师范大学生命科学学院 大连 116029) (3中国科学院遗传研究所 北京 100101) 摘要 研究影响农杆菌介导的苹果主栽品种遗传转化的若干因子效应，建立起新乔纳金苹果 简单、高效的遗传转化系统。外源基因向新乔纳金苹果细胞转移的效率明显高于t.f家嘎拉和 富上苹果。菌株EHA105介导基因转移的能力比菌株LBA4404明显高。用乙酞-1.香酮、磷酸 饥饿、低pH值等vir基因诱导因子处理菌株EHA105的细胞，未能提高转化效率。叶片在菌液 中的浸泡时间不仅影响基因转移效率，而且影响头抱霉素对外植体上农杆菌生长的抑制效 果。共培养时，叶片远轴面与培养基接触比近轴面与培养基接触的转化效率高。 关键词 苹果，转化，根癌农杆菌，基因表达 分类号 Q785 苹果 M（alusxdomesticaBorkh.）是落叶果树中主要栽培的树种之一。ii于其高度的 杂合性及漫长的世代周期，所以通过常规杂交育种对其改良是困难的。利用基因转移技 术向植物导人外源基因对植物基因型和表现型改良具方向性，而果树又具有无性繁殖特 性，因此，通过基因工程技术对苹果进行遗传改良更具有重要意义。自1989年英国East Mailing园艺研究所的James等首先报道苹果遗传转化取得成功以来t;［关F苹果遗传转 化的研究已有一些报道2［-51。苹果遗传转化成功与否在很大程度上决定于试材基因型，至 今 国际上公开报道获得苹果转基 因植株 的基 因型仅有4个，即苹果品种绿袖 (Greenseleeves)、元帅D（elicious)、皇家嘎拉R（oyalGala）和营养系砧木M26。另外，在苹 果遗传转化中还普遍存在转化效率不高等问题需要进一步研究。本研究目的在于了解影 响农杆菌介导的遗传转化的若干因子效应，建立苹果主栽品种简单、高效、优化的遗传转 化系统，以便进一步利用基因工程技术对苹果进行改良。 1 材料和方法 1.1植物材料 苹果M（alusxdomesticaBorkh.）主栽品种新乔纳金、宫崎富士、皇家 嘎拉的试管苗以单芽茎段方式增殖继代，继代培养基为附加BA0.25mg/L和IAA 0.lmg/L的MS培养基。在苗龄为30.33天的试管苗上剪取幼嫩、平展的叶。选取的叶 本文于1996-10-21收到，1997-03-31修回 本研究在辽宁省植物生物工程重点实验室完成 2期 张志宏等：苹果主栽品种高效遗传转化系统的建立及其影响因子的研究 161 在大小、形状和色泽上基本一致，从而使叶在生理、生化状态上基本保持一致。每片叶横 剪3刀，以中间两段 宽（2-3mm）作为转化的外植体。 1.2 根癌农杆菌菌株及载体 实验使用根癌农杆菌菌株EHA105(pMOG410)和 LBA4404(pRCL27)两个菌株。菌株EHA105是Hood等1993年宣布获得的具强致病性的 菌株6[1［。双元载体pMOG410携带一个嵌合的NOS.NPT11基因和一个嵌合CaMV35S GUSINT基因。由于GUS.INT基因只在植物中表达而不在细菌中表达，因此可以早期检 测GUS基因在植物中的瞬时表达。双元载体pRCL27携带NPTII基因和CpTI基因，以 Ca1VIY35S为启动子。 1.3 转化方法 采用叶盘共培养的转化方法。接种菌的叶片在附加BA6.0m留L, IAAO.8mg/L的MS培养基 含［蔗糖2.5%(WIV),葡萄糖0.5%(W/V)]上共培养3天。共培养 后的叶片在附加TDZ3.OmglL,IAA0.5mg1L,LH200mg1L,Km25m;1L,Cef200mg1L的 MS培养基上选择培养。包括共培养在内，外植体均先暗培养3周，然后移至光下培养。 1.4 转化效率的评价指标及方法 在叶片接种菌后的第5天，通过GUS组织化学染色 法171检测叶片中GUS基因瞬时表达T（ransient