0104第十一讲体外受精嵌合体.ppt

小鼠脾细胞制备 兔抗鼠抗血清制备 血清效价测定 胚胎的获取 嵌合胚制备 免疫手术及胚泡注射法小鼠嵌合体制备 小鼠脾细胞制备 选取健康小鼠 取出脾脏 过滤 匀浆 消毒皮肤 细胞计数 洗涤 兔抗鼠抗血清制备 注射小鼠脾细胞 107/只 选取健康兔5只 每周加强一次 最后一次免疫十天后心脏或动脉插管取血 血清分离及纯化 5次免疫后测效价 取条形板一块 每孔加生理盐水200μl 血清效价测定 将血清倍比稀释 取少量小鼠全血用生理盐水稀释至一毫升 每孔加等量小鼠血细胞 两小时后看结果 胚胎的获取 小鼠超排处理 手术取胚 胚胎质量鉴定 冲胚操作 胚胎体外培养 内细胞团分离 补体血清制备 透明带去除 抗体与滋胚层结合 抗血清灭活 补体结合 去除细胞碎片 嵌合胚制备 固定管及注射针的制备 操作方法的选择 胚胎及内细胞团的存放 三针法 单针法 (2)ICM重组法 为了解ICM的发育分化潜力及其影响因素，采用从受体囊胚中去掉原有的ICM，移入新的ICM，称为囊胚重组(Reconstitution of blastocyst)，或称ICM置换(ICM excheng)。其步骤见图。 18.3嵌合体鉴定 亦可称嵌合体标记(Markers of chimera)和嵌合体分析(Analysis of chimeras)，它是嵌合体制作的关键一步。不论是实验获得，还是自然产生的嵌合体都需要采用识别方法来证实是否是真正的嵌合体。 迄今所用的嵌合体鉴定方法大致分为人工标记(活体染色色素)和遗传标记两种。 18.3. 1．人工标记 其最典型的标记物是活体染色色素和油滴。此外，使用的标记物还有0．1—0．2um的珠状物，放射性物质(主要是3H—脱氧胸腺嘧啶核苷)、荧光胶质金、黑色素颗粒、山葵过氧化物等，这类标记物多用于蛙类嵌合体的鉴别，哺乳动物中较少用。 18.3.2．遗传标记 遗传标记能稳定地继承遗传上的差异，是最适宜的标记方法。它是根据嵌合体在嵌合前两个胚胎本身所具有的特性作为标记来进行鉴别。如黑色素以及通过生物化学(活性酶)、染色体、细胞学、组织学、组织化学、免疫组织化学等方法能够鉴别的物质等。目前常用的方法有： （1）色素分析法 这是最简单的直观分析法，一般选择肤色、毛色差异的动物来制作前合体。 （2）生物化学法 主要通过嵌合体血液或组织中特定的酶，如磷酸葡萄糖异构酶（GPI）、磷酸葡萄糖转移酶（PGM-1）、6—磷酸葡萄糖脱氢酶(6—PGDH)等，也可以根据细胞抗原、血清运铁蛋白和白蛋白类型来确定是否有亲缘关系，以鉴定是否是嵌合体。 (3)形态学方法 通过细胞学、组织形态学及染色体组型、染色体数目、性染色体特征对嵌合体作出鉴定。 (4)组织化学方法 主要是通过免疫组织化学方法进行鉴定。如用磷酸葡萄糖异构酶抗体(GPI—1B的抗体)进行组织器官鉴定，就能确定器官组织中嵌合的程度和细胞的分布。 今后随着分子生物学的发展，可采用DNA克隆探针来进行嵌合体的鉴别，这将是一种快速准确的方法，但目前使用最多的是色素和同位素等遗传标记方法。 18.4嵌合体动物的应用 利用嵌合体动物的特性，可应用于以下几下主要方面。 18.4.1．发育生物学领域 可作为分析哺乳动物发生机制的一种手段而广为利用。 (1)卵裂球的分化能力  细胞分化是发育生物学的核心问题。嵌合体技术可将不同时期、不同来源、基因型不同的胚胎细胞通过注入和融合，进入同一发育环境中，根据它们在组织和器官中的存在与否，来确定其发育程度，卵裂球的分化能力和参与胚胎、个体发育的程度。利用种间嵌合体个体进行上述研究更为有效。 (2)性别分化  正常受精卵的性比(♀:♂)为1XX:1XY，将其进行聚合并发育为个体时，其性别组成为XX／XX、XX／XY和XY／XY，所以嵌合体个体的性比应当是1：2：1。迄今已查明嵌合体动物的性比大约为2：1。 此外，还可以进行X染色体的失活及其作用和在性腺功能中基因作用的分析。 (3)基因的表达机制 将基因组明显不同的二组或三组卵裂球聚合，以各卵裂球的特异性抗血清或DNA克隆探针为标记，分析在嵌合体发育过程中这些卵裂球细胞的顺序和相互间分化能力的关系，从而查明细胞间的遗传信息与发育的关系，以及分化后在组织和 器官中的位置。 18.4.2．生理功能分析 (1)免疫功能的分析 利用血液的嵌合体，通过分析血细胞嵌合体中的免疫应答，查明正常个体的防御机制。 (2)遗传病模型动物 通过嵌合体技术培育具有人类遗传病的模型动物，以研究这