结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合肽的表达和分离纯化.pdf

结缔组织生长因子（CTGF）特异性结合肽的表达及 结结缔缔组组织织生生长长因因子子（（CCTTGGFF））特特异异性性结结合合肽肽的的表表达达及及分 离纯化 1 2 1 王明虹 ，吴国球 ，刘乃丰 1．东南大学临床医学院心血管研究所 江苏南京 210009 2．东南大学附属中大医院临床检验中心 江苏南京 210009 E-mail: wangminghong@. 〖摘要〗目的 方法 〖〖摘摘要要〗〗目目的的 利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子（CTGF）特异性结合的小肽。方方法法 设 计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段，插入pET-32(a) 质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下+ 游，构建重组质粒，转入E.coli BL21表达菌中，用IPTG诱导表达融合蛋白；用热变性和硫酸铵 分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化，再用亲和层析进一步纯化，经肠激酶切割后用凝胶过滤层 结果 析分离获得目的小肽；用反相色谱对小肽进行纯度鉴定。结结果果 构建的重组质粒测序结果与预期 序列一致；诱导表达后用SDS鉴定，发现在20Kd处有浓密的表达条带出现，与预期分子量 一致；融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化，得率分别为78.6％和52.3％；用亲 和层析纯化得率50.5％；经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽，用反相色谱鉴定 结论 其纯度大于95%；最终每升发酵液获得3.4mg目的肽。结结论论 成功制备CTGF特异性结合肽，为进一 步研究该小肽的生物学活性打下基础。 关键词 关关键键词词：结缔组织生长因子，分离纯化，特异性肽 中图分类号：Q78 文献标示码 A 中中图图分分类类号号：：QQ7788 文文献献标标示示码码：AA 引言 [1] 结缔组织生长因子(connective tissuegrowthfactor,CTGF)是Bradham 等人于1991年首次在 人的脐静脉内皮细胞培养基中发现的细胞因子，由349个氨基酸残基构成；主要由皮肤成纤维 [2] [3] [4] [5] [6] 细胞 ，肾小球系膜细胞 ，肝星状细胞 ，肺成纤维细胞 ，血管平滑肌细胞 等合成分泌。 [7-8] [9-11] [12] CTGF可以促进细胞增殖、合成胶原；介导细胞黏附 ；诱导细胞凋亡 ；促进血管形成 ； 刺激成纤维细胞生长，并参与调节细胞分化、胚胎发育以及伤口愈合，在多种器官和组织纤维 化的发生、发展过程中起重要作用。本研究是在先前我们用噬菌体展示技术发现的结缔组织生 [13] 长因子特异性结合肽的基础上 ，利用基因工程技术制备该小肽，为进一步研究其生物学活 性，开发成CTGF小分子抑制剂打下基础。 1 11 材料和方法 1.1 11..11材料：BL21（DE3）[HsdS gal(λcIts857 indI Sam7nin5 lacUV5-T7I)]，JM109，本实验室保 + TM 存；pET-32(a) 质粒，肠激酶试剂盒，Novagen公司；H