PCR样品DNA或RNA提取.pptx

蜜蜂分子生物学通用技术-PCR检测应用实例;蜜蜂样本的采集、标记及保存;蜜蜂样本分布图;主要试剂;??制冰机、低温离心机（eppendorf centrifuge 5004R）、移液枪（Gilson，10μl、20 μl、100 μl、200 μl、1000 μl量程）、无菌枪头（10μl、20 μl、100 μl、200 μl、1000 μl）、漩涡混合器（Labnet VX100）、掌式离心机（ISC BioExpress）、电子天平（Mettler AE100）、超净工作台（PCR Chamber）;从-80℃冰箱中取出单个蜜蜂样本放入已标记的1.5ml离心管中，用一次性塑料研磨棒快速捣碎，在无菌工作台内加入500μl细胞裂解剂（TRIzol），漩涡震荡1min。室温孵育3min，充分降解样品中的核酸蛋白； 每个离心小管加入100μl氯仿后盖好盖子，上下剧烈震荡50次后置于室温下孵育3分钟； 放入低温离心机内，在4℃下10,000rpm离心10min。样本混合液分离为下层的红色的苯酚氯仿层和无色上清水溶液。样品总RNA被溶解在上清水溶液中；;将离心管内的上清水溶液移入另一个1.5ml离心管中，加入500μl乙丙醇，上下倒置混匀　后，室温静置10min后，4℃下12,000rpm离心15min。粉红色RNA析出物沉淀于离心管壁内侧； 倒掉离心管内溶液，加入70%乙醇500μl，漩涡震荡20sec清洗RNA沉淀物，4℃下　　9,000rmp离心5min； 倒掉管内乙醇溶液，并用高压灭菌滤纸吸去离心管内剩余乙醇； 加入100 μl去RNA酶无菌水溶解RNA沉淀，立即放入-80℃冰箱保存。;总RNA的纯度和浓度检测;病毒;试剂 Reagent;将配好的RT-PCR反应液放入PCR仪中进行扩增，反应程序如下： ① 逆转录，48℃,45min； ② 逆转录酶灭活，94℃,2min； ③ 变性，94℃，30sec； ④ 退火，60℃，60sec； ⑤ 延伸，68℃，120sec； （3）→（5）进行40个循环； ⑥ 最后在68℃条件下，延伸7min后，结束反应， 产物保存于4℃冰箱中。;PCR反应产物凝胶电泳检测;PCR反应产物凝胶电泳检测;PCR反应产物回收;DNA序列测定;DNA序列的比对：登陆NBCI，进入Blast 的核酸序列数据库，比对所得序列数据。