第2单元 聚合酶链式反应-2011 分子生物学.ppt

第三章 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR） 聚合酶链反应 又称体外DNA扩增技术。是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术。它能快速将皮克(pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右，达到微克(?g)水平。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等。 在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。 并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，便于对目的基因进行分析、鉴定。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂,一般需要数周时间。 PCR技术的发现 70年代的初期由Dr. H. Klenow发现了较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli ； 1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的Taq polymerase ，它的特性能耐高温。 80年代之后它被广泛运用； 1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法； 1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值的PCR技术； 1987年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。 1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。 一、PCR基本原理 PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。 依据DNA半保留复制的机理。 PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。 细胞内复制的过程 1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。 2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3’-OH末端。 3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引物的3’端，循5’→3’方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA双链。 PCR的基本过程 1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为模板（待拷贝的 DNA 称为模板） 。 2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55℃左右)，5’端和3’端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合。 3. 延伸：将温度升到75℃左右，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种 dNTP，从引物3’-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链。 PCR的扩增效应 理论上，每增加1个循环，双链DNA片段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n)增加。 实际上，扩增效应低于指数增加，约为(1+X)n。 一般进行30个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加 106 倍。 PCR产物的积累规律 PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平台效应”。 到达平台期所需要的循环次数一般在30次循环之后。 PCR仪 聚合酶链反应中的变性、退火、延伸的温度和时间，以及循环次数，是由具有程控的快速升温和快速降温装置的PCR仪控制。 PCR仪 二、PCR技术的特点 1. 高度的敏感性：可将极微量(pg)DNA，扩增到紫外光可见的水平(ug)，这是最主要的特点，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。 2. 高度的特异性：PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定，因此引物设计至关重要。 ①引物与模板DNA特异正确的结合；②遵循碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 3. 适用样品的广泛性： 对样品的要求并不十分严格： 1)可以是DNA，也可以是RNA 2)可以是纯化的，也可以是粗制的 3)可以是新鲜组织，也可以是陈旧组织 4)可以是细胞，也可以是体液 4. 操作简便、快速：PCR自动化，数小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 三、参与PCR反应体系　 的因素及其作用 模板 引物 Taq DNA聚合酶 dNTP Mg2+ （一）模板—核酸 1. 模板：指能扩增靶DNA片段的核酸 2. DNA是直接模板，RNA是间接模板 （二）引 物 1）引物：2条人工合成的、能与模板DNA互补结合的脱氧寡核苷酸。 2）引物的序列：根据欲扩增的DNA片段两端序列而设计的。 2. 引物设计的基本要求 1）引物长度要