2016上海交通大学遗传学实验DNA提取.pptVIP

实验八、植物基因组DNA提取 一、实验目的 了解植物基因组DNA提取的原理 掌握植物基因组DNA提取的方法 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术 掌握用紫外分光光度计测定DNA浓度的方法 1. 获取细胞： 研磨、匀浆…… 2. 裂解细胞： 冻融、SDS…… 3. 分离DNA： CTAB 、苯酚…… 4. 纯化DNA 乙醇、RNA酶…… 二、实验原理 真核细胞的核基因组存在于细胞核内，所以提取真核基因组DNA需要先破碎细胞膜和核膜，然后分离和纯化DNA。提取过程中要防止酸、碱和DNA酶对DNA的降解 1. 获取细胞 动物 植物 微生物或 培养细胞 液氮 研钵 取少量组织，速冻 + 离心 上清(弃) 沉淀(留) 研磨 细胞 2.裂解细胞 3.分离DNA CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，阳离子去污剂 ,是一种强变性剂, 变性效果优于SDS , 能够有效除去蛋白(含复合蛋白)等杂质。 4.纯化DNA 用酚氯仿抽提除去残留蛋白质；用70%乙醇对核酸沉淀进行洗涤以除去溶于70%乙醇的NaCl等杂质；加入RNA酶以除去RNA 1. 菠菜 Spinacia oleracea 2n=12 2. 番茄 Solanum lycopersicum 2n=24 三、实验材料和试剂 试剂 DNA提取缓冲液 DNA裂解缓冲液 氯仿∶异戊醇（24：1） 异丙醇 70%乙醇 TE缓冲液 表 1 DNA提取缓冲液配制 工作液 ml ml 存储液 0.35M Glucose 34.68g 6.936g Glucose 0.1M Tris.HCl 50 10.0 1.0M Tris.HCl(pH 8.0) 5mM Na.EDTA 5 1.0 0.5M EDTA(pH 8.0) 2% PVP 100 20.0 10% PVP 1%(V/V)β-Me 5 1.0 Liquid dd Water 340 68.0 Total 500ml 100ml 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 Tris-HCl?(pH8.0): 提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;? EDTA: 螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;? β-巯基乙醇: 是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质, 有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。 表2 裂解缓冲液配制  工作液 ml ml 存储液 1.4M NaCl 40.908g 8.1816g Salt 0.1M Tris.HCl 50 10 1.0M Tris.HCl(pH 8.0) 20mM Na.EDTA 20 4 0.5M Na.EDTA(pH 8.0) 2%CTAB 100 20 10% CTAB 2% PVP 100 20 10% PVP 1%(V/V)β-Me 5 1.0 Liquid dd Water 225 45 Total 500ml 100ml NaCl?:提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,存在于液相中 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵): 是一种阳离子去污剂, ?在高离子强度的溶液中(0.7mol/L?NaCl), 与蛋白质和多聚糖形成复合物。 DNA提取缓冲液 DNA裂解缓冲液 氯仿∶异戊醇（24：1） 异丙醇 70%乙醇 TE缓冲液 氯仿：是强蛋白质变性剂，抑制RNA酶的活性，除去蛋白质污染。氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开。 异戊醇：是消除抽提过程中出现的泡沫，让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 异丙醇：沉淀DNA。? 70%乙醇：洗涤DNA沉淀，因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子可溶?. TE: 主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA。 提取步骤 所有材料幼嫩叶片保存于-70°C的冰箱中，DNA提取采用修改的CTAB法，具体步骤如下： （1）将100-200mg冻叶（或鲜叶）放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。将研磨的粉末转入2ml离心管中，加入800μl新鲜配制的提取缓冲液（表11），涡旋混匀，冰浴保存。10000rpm 离心10min（4℃），弃上清; （2）于沉淀中加入700μl 65℃预热的裂解缓冲液（表2），并用牙签搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min; （3）加入750μl氯仿∶异戊醇（24：1）混合液，翻转50次以上，10000rpm离心10min（4℃），将上清转入2ml的离心管中; （5）加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min。弃上